細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)

2016-01-27

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用越來越廣泛。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染原理圖

技術(shù)內(nèi)容：將外源分子如DNA,RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞

研究?jī)?nèi)容：研究和控制真核細(xì)胞基因功能

應(yīng)用：基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的分類

1、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控原件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。

目的：快速分析

篩選方法：抗生素抗性

表達(dá)持續(xù)時(shí)間：隨細(xì)胞分裂而稀釋至丟失48－72小時(shí)

目的DNA與宿主染色體：未整合

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整個(gè)率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1、104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶，潮酶素B磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸苷激酶等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

目的：為獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的單細(xì)胞克隆

篩選方法：抗生素抗性

表達(dá)持續(xù)時(shí)間：隨宿主細(xì)胞本身基因組一樣復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，并被穩(wěn)定遺傳

目的DNA與宿主染色體：未整合

常見細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法介紹

1、DEAE-葡聚糖法

是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。

2、磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法

由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA。

3、脂質(zhì)體介導(dǎo)法（目前應(yīng)用最廣泛）

原理：陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑與DNA混合后，形成一種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物，DNA被包在脂質(zhì)體中間，這種脂質(zhì)雙層復(fù)合物可直接加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，脂質(zhì)體粘附到細(xì)胞表面并與細(xì)胞膜融合，DNA被釋放到胞漿中。

【主要應(yīng)用】:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染.

【特點(diǎn)】：使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，很大程度上應(yīng)用受限制。

4、物理方法(電穿孔、顯微注射及基因槍)