PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

• 凝膠電泳分析：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳
• 酶切分析
• 分子雜交：Southern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交
• 核酸序列分析

PCR的反應(yīng)條件

• 反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）
• 反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）
• 循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）

PCR反應(yīng)的特點(diǎn)

• 特異性強(qiáng)：引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性  
• 靈敏度高：指數(shù)增長(zhǎng)，從pg (10-12)可擴(kuò)增至 mg (10-6)水平 
• 簡(jiǎn)便、快速：2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增
• 對(duì)標(biāo)本的純度要求低：DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板 

1.1 PCR技術(shù)概述及原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA為模板，以特定的核酸片段即PCR引物為擴(kuò)增起點(diǎn)和終點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外體系中復(fù)制出大量與母鏈模板中所需的DNA片段互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。
PCR的最大特點(diǎn)是其擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、擴(kuò)增效率的靈敏性、擴(kuò)增程序的簡(jiǎn)便性。引物序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。PCR技術(shù)是一種DNA體外合成放大技術(shù)，具有擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增特異性高，擴(kuò)增體系和技術(shù)簡(jiǎn)便成熟的特點(diǎn)，是當(dāng)今生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室最廣泛使用的一項(xiàng)技術(shù)。

1.1.1 PCR的循環(huán)步驟

PCR反應(yīng)過程實(shí)際上是一個(gè)溫度循環(huán)變化的過程，一般包括變性---退火---延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，其基本步驟如下：
（1）模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至92～96℃以上保溫1～3分鐘，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；雖然變性時(shí)間決定于多種因素模板DNA的復(fù)雜性、反應(yīng)管的幾何學(xué)、PCR儀的種類甚至反應(yīng)體積，但是實(shí)際經(jīng)驗(yàn)中，94℃保溫3分鐘即可以滿足絕大部分反應(yīng)的需求。另外，對(duì)于GC含量較高的DNA模板，加入甘油、延長(zhǎng)時(shí)間、應(yīng)用核酸類似物可以提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。
（2）模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，37～65℃保溫0.5～1分鐘，寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；這一步的溫度取決于引物與靶序列的同源性程度和寡核苷酸引物的堿基組成。引物的摩爾數(shù)由于絕對(duì)大于靶序列，因此它們與互補(bǔ)序列的配對(duì)速度在反應(yīng)中比模板雙鏈之間的重新配對(duì)要快幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
（3）引物的延伸：DNA模板---引物結(jié)合物體系在68～72℃延伸保溫相應(yīng)時(shí)間（此步驟具體溫度視熱穩(wěn)定DNA聚合酶的種類而定，而保溫時(shí)間則在考慮DNA聚合酶效率的基礎(chǔ)上，依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的長(zhǎng)度決定，如目前最常用的DNA聚合酶Taq酶在72℃下每分鐘約可以擴(kuò)增長(zhǎng)度為1Kb左右的DNA片段，因此要擴(kuò)增兩2Kb的DNA片段時(shí)本步驟的保溫溫度應(yīng)設(shè)置為72℃、時(shí)間為2分鐘），在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性---退火---延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板使得每個(gè)循環(huán)中新擴(kuò)增的目的片段數(shù)量以指數(shù)式增長(zhǎng)。經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)之后，待擴(kuò)目的DNA片段的數(shù)量將被擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

1.1.2 PCR一般反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)的組分一般包括：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四種脫氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反應(yīng)緩沖液、Mg2+等。目前，PCR反應(yīng)已經(jīng)全部在PCR儀中進(jìn)行，且普遍采用商業(yè)化的PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，因此一般研究者只需要準(zhǔn)備自己的模板DNA和PCR引物，然后按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作即可；對(duì)于PCR系統(tǒng)各個(gè)組分的了解是進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，尤其是在擴(kuò)增結(jié)果不理想的時(shí)候，可依此改進(jìn)實(shí)驗(yàn)以獲得滿足實(shí)驗(yàn)需求的擴(kuò)增結(jié)果。

一般普通的PCR反應(yīng)體系中主要包括下列組分：
（1）模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，通常標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備的樣品都可以直接作為模板使用，無需特別處理，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。需要指出的是，模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。另質(zhì)粒、預(yù)先擴(kuò)增的到的片段等小片段DNA作模板時(shí)，擴(kuò)增的效率會(huì)明顯高于基因組DNA為模板的反應(yīng)，因此在使用小片段DNA作模板時(shí)，要盡量降低模板的量，10-9g至10-12g級(jí)即可。
（2）引物：引物在PCR反應(yīng)中的終濃度一般為1μmol/L，濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。商業(yè)公司合成的干粉狀引物一般可用ddH2O或溶解為100μmol/L，－20℃儲(chǔ)存，使用時(shí)按比例加入體系即可。
（3）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲(chǔ)濃度為10mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。需要說明的是，dNTPs的濃度改變會(huì)影響有效的Mg2+濃度，因此若dNTPs得濃度增加，Mg2+濃度亦應(yīng)該增加。
（4）鎂離子：Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和PCR的產(chǎn)率。Mg2+的工作濃度為1.5～2.0mM，其對(duì)應(yīng)dNTP為200μmol/L；以Taq酶為例，由于dNTP與Taq酶競(jìng)爭(zhēng)Mg2+，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。鎂離子的使用是嚴(yán)格的，其作用優(yōu)于錳離子，鈣離子則無效。
（5）無Mg2+buffer：主要有H2O、KCl、Tris組成。Tris用于控制反應(yīng)體系中的pH值，保障DNA聚合酶的反應(yīng)活性；不超過50mM的KCl可以降低退火溫度，但是過高的KCl會(huì)抑制DNA聚合酶的活性。
（6）DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR擴(kuò)增得以進(jìn)行的保證，目前的PCR技術(shù)中使用的都是熱穩(wěn)定性酶，避免了PCR技術(shù)應(yīng)用初期需在每一次變性后重新加酶的繁瑣工作。目前最常用的Taq酶能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。Taq酶的缺點(diǎn)是沒有3’→5’的外切酶活性，因此沒有校正功能，某種dNTP或Mg2濃度過高,會(huì)增加其錯(cuò)配率，因此在進(jìn)行精密PCR實(shí)驗(yàn)室，建議使用有3’→5’的外切酶活性的高保真的聚合酶。聚合酶的用量一般按試劑盒說明書的推薦用量添加即可。
除了以上標(biāo)準(zhǔn)成分以外，一些研究者或者試劑盒推薦在體系中添加明膠、TritonX-100或BSA（小牛血清白蛋白）來增加酶的穩(wěn)定性，可能的原因是它們起著減少PCR管對(duì)聚合酶的吸附作用，以使聚合酶盡可能參與到反應(yīng)中。
另外，甘油、二甲亞砜、甲酰胺可以提高特異性,這些成分可能是通過降低解鏈和鏈分離溫度使模板變性更容易并提高了引物退火特異性來實(shí)現(xiàn)提高PCR反應(yīng)特異性的目的。

1.2引物設(shè)計(jì)

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)的一般思想

PCR反應(yīng)擴(kuò)增成功的一個(gè)關(guān)鍵即是引物的正確設(shè)計(jì)，尤其在目前已有大量PCR試劑盒免去研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)體系、條件的繁復(fù)摸索的條件下，研究者只需自行準(zhǔn)備模板和引物即可。
引物設(shè)計(jì)的核心思想是在擴(kuò)增的特異性和效率之間取得平衡。特異性指擴(kuò)增得到非目標(biāo)片段的頻率；擴(kuò)增效率指在每一個(gè)循環(huán)中一對(duì)引物引起的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量與理論上應(yīng)獲得的產(chǎn)量的接近程度。
目前市面上提供大量的引物設(shè)計(jì)軟件，這些軟件基本都基于以下幾點(diǎn)考慮引物質(zhì)量：可能引起非靶序列的假陽性擴(kuò)增，引物本身的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物二聚體的形成等，假陽性擴(kuò)增與引物特異性相關(guān)，引物發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體的形成對(duì)擴(kuò)增效率有較大影響。

1.2.2引物的組成

引物的主體通常是一段5’→3’的與靶序列嚴(yán)格互補(bǔ)的寡核苷酸短鏈，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的，許多時(shí)候會(huì)在引物的5’添加限制性酶識(shí)別位點(diǎn)等與本次PCR無關(guān)序列或其它各種修飾,這些修飾通常不會(huì)影響引物的第一次正常退火和擴(kuò)增，而在后續(xù)的循環(huán)中，由于已有可互補(bǔ)的模板，體系亦可正常進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮的幾個(gè)因素

（1）引物長(zhǎng)度：PCR擴(kuò)增的特異性由引物的長(zhǎng)度和退火溫度控制，當(dāng)反應(yīng)的退火溫度接近Tm值時(shí)，18～24個(gè)堿基長(zhǎng)度的引物有著卓越的特異性。
理論上認(rèn)為在引物上每增加一個(gè)堿基特異性會(huì)增加4倍，因此引物越長(zhǎng)堿基數(shù)越多特異性越突出，但是引物越長(zhǎng)，退火時(shí)可以被其引發(fā)的模板也會(huì)越少，再經(jīng)過指數(shù)擴(kuò)增期放大后，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)明顯減少。因此若非特殊需要，一般引物的互補(bǔ)序列部分不需要超過25個(gè)堿基。
而引物越短，其在退火時(shí)結(jié)合到靶序列上的幾率就越高，因此引物中與靶序列互補(bǔ)部分堿基太少會(huì)引起不必要的非目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。
（2）GC%和Tm值：Tm值指的是引物與模板結(jié)合的雙鏈體的解鏈溫度。較低的Tm值導(dǎo)致引物特異性的喪失，這種情況下將出現(xiàn)大量的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。Suggs在1981年提出的Tm＝2（A+T）+4（C+G）公式，由于簡(jiǎn)便和相對(duì)精確一直受到廣大研究者的好評(píng)。對(duì)于一條大約20個(gè)堿基的引物，基于上述公式，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)CG%在50%左右時(shí)Tm值約在56℃～62℃，較適合進(jìn)行PCR反應(yīng)，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)選?。ˋ+T）和（C+G）數(shù)量大致相當(dāng)?shù)男蛄?。尤其?yīng)注意使上下游兩條引物的Tm值盡量接近，比較理想的情況是相差2～3℃以內(nèi)，這樣可以使PCR反應(yīng)中進(jìn)行退火時(shí)上下游引物結(jié)合靶序列的效率相當(dāng)，以獲得穩(wěn)定且足夠數(shù)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。
需要特別指出的是，在進(jìn)行PCR反應(yīng)設(shè)置退火溫度時(shí)，不管是公式推算還是軟件預(yù)測(cè)或者引物合成公司提供的Tm值，實(shí)際上都只能用于參考，每一個(gè)PCR反應(yīng)的實(shí)際退火溫度理論上都是未知的，通常第一次擴(kuò)增時(shí)退火溫度設(shè)置為參考Tm值+2或4℃，之后根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
（3）引物在靶序列內(nèi)的位置：除了有特定而精確的目的片段以外，大部分的實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物長(zhǎng)度是可以在一定范圍內(nèi)進(jìn)行適度選擇的，根據(jù)PCR產(chǎn)物的用途、模板的特點(diǎn)和所用聚合酶的特性，可以選擇合適的產(chǎn)物長(zhǎng)度，一般實(shí)驗(yàn)中的PCR反應(yīng)通常選擇在150～1000bp之間，而若只是為了檢查某段特異性序列則只需要120～300bp就已足夠。
在靶序列上選擇引物的時(shí)候，注意避開成串單一堿基的區(qū)域，避開連續(xù)的CG序列，盡量選擇四個(gè)堿基分布較隨機(jī)的區(qū)域，這樣可以減少引物自身同源的機(jī)會(huì)，避免擴(kuò)增過程中引物的不必要消耗；同時(shí)在上下游兩引物之間也不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。另外尤其要注意3’末端的序列，若非有特定作用，這段序列一定要與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G，因?yàn)門錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸。

1.3 PCR的特異性、效率和忠實(shí)性

PCR的特異性、效率和忠實(shí)性是體現(xiàn)一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量的三個(gè)重要指標(biāo)。特異指一個(gè)PCR反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，即預(yù)期的靶序列。效率指每個(gè)循環(huán)里擴(kuò)增的實(shí)際產(chǎn)物的量與理論上應(yīng)該達(dá)到的量的接近程度。忠實(shí)是指在PCR反應(yīng)過程中，由DNA聚合酶誘導(dǎo)的錯(cuò)配是可以忽略不計(jì)的。
這三個(gè)參數(shù)中的每一個(gè)都受到PCR反應(yīng)中眾多成分的影響，包括緩沖體系、酶、模板甚至PCR循環(huán)程序，但最遺憾的是，高特異性的反應(yīng)條件與高產(chǎn)量的反應(yīng)條件并不一致，同時(shí)高保真也往往導(dǎo)致低產(chǎn)率。因此在設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，有針?duì)性地對(duì)這三個(gè)參數(shù)有側(cè)重地優(yōu)化。如在片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析時(shí)，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性就比忠實(shí)性重要；而若是研究個(gè)別DNA分子或稀有突變，忠實(shí)性的重要性不言而喻。
特異性是PCR的基礎(chǔ)，它首先取決于引物設(shè)計(jì)與模板的精確互補(bǔ)。一套理想的引物能有效地與靶序列雜交，而與模板中出現(xiàn)的其它序列的雜交可以忽略不計(jì)。一般引物與模板中非靶序列發(fā)生4個(gè)或更少連續(xù)堿基互補(bǔ)都不會(huì)在電泳時(shí)體現(xiàn)出來。
PCR反應(yīng)的效率影響特異性產(chǎn)物的積累，根據(jù)Chien等人給出的靶序列的累積與循環(huán)數(shù)的函數(shù)關(guān)系，擴(kuò)增效率最高的時(shí)期為29個(gè)循環(huán)之前的指數(shù)增長(zhǎng)期，之后每次循環(huán)的效率就開始大大降低，產(chǎn)物停止指數(shù)積累，此時(shí)理論上靶序列的拷貝數(shù)已達(dá)到1012，而1012拷貝的特定序列對(duì)于絕大多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已滿足要求，且PCR的許多應(yīng)用尤其是定量實(shí)驗(yàn)都要求擴(kuò)增在指數(shù)生長(zhǎng)期完成，因此，一般PCR反應(yīng)都在29個(gè)循環(huán)之前取出，沒有必要再增加循環(huán)數(shù)。
PCR反應(yīng)的忠實(shí)性主要與酶有關(guān)，雖然可以通過改變反應(yīng)緩沖液的條件大大提高忠實(shí)性，但是也遠(yuǎn)比不上更換高保真的聚合酶的效果。聚合酶的高保真能力體現(xiàn)在其擁有3’→5’的外切酶校正活性。需要指出的是，不論是否使用高保真的聚合酶，PCR的過程都有可能有錯(cuò)誤堿基滲入，因此在對(duì)忠實(shí)性有要求的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)PCR得到的序列必須測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 PCR的優(yōu)化

在PCR實(shí)驗(yàn)中，最顯而易見的一對(duì)矛盾是擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生大量不確定、不需要的產(chǎn)物，或者沒有擴(kuò)增到任何產(chǎn)物，這個(gè)矛盾的實(shí)質(zhì)就是PCR的高特異性和高效率所需的條件不一致。
下面給出有利于增加PCR特異性的部分條件，往反方向調(diào)整即可增加擴(kuò)增效率，但是會(huì)降低特異性，因此最佳目標(biāo)是尋得兩個(gè)方向之間的平衡。

有利于增加PCR特異性的調(diào)整條件：
（1）使用熱啟動(dòng)技術(shù)
（2）使用降落PCR技術(shù)
（3）優(yōu)化引物設(shè)計(jì)
（4）加入或優(yōu)化增強(qiáng)劑
（5）優(yōu)化反應(yīng)體系，包括pH值，甚至改變反應(yīng)體積
（6）提高退火溫度
（7）提高模板的變性效率
（8）降低Mg2+濃度
（9）降低dNTPs的濃度
（10）降低聚合酶的量
（11）降低引物濃度
（12）降低模板濃度
（13）減少循環(huán)數(shù)
（14）減少每個(gè)循環(huán)中各部分的時(shí)間
如上所述，通常影響一個(gè)PCR反應(yīng)的條件很多，因此，在實(shí)際操作中假如進(jìn)行全矩陣分析尋找最佳條件將費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，研究過程中可以只針對(duì)相關(guān)的主要變量進(jìn)行調(diào)整。在重點(diǎn)考慮引物與模板的配對(duì)及酶的忠實(shí)性的情況下，Mg2+濃度和退火溫度是對(duì)擴(kuò)增影響最顯著的因素，因此可以只針對(duì)這兩個(gè)變量進(jìn)行簡(jiǎn)單的小矩陣分析。降落PCR實(shí)質(zhì)上就是一個(gè)在系列梯度溫度中尋找到有效退火溫度，并適度保證特異性的方法。

1.5 PCR常見問題

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)與保存
PCR結(jié)束后最好立即檢測(cè)，一般不要超過48小時(shí)；產(chǎn)物保存于－20℃待用，或者純化后保存。

假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：（1）模板核酸的制備；（2）引物的質(zhì)量與特異性；（3）酶的質(zhì)和量；（4）PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：（1）模板中含有雜蛋白質(zhì)；（2）模板中含有Taq酶抑制劑；（3）模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；（4）在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；（5）模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：（1）選定一個(gè)好的引物合成單位；（2）引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度；（3）引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效；（4）引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μl、30μl、50μl，或100μl，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μl 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性，退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

假陽性，出現(xiàn)擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致
有時(shí)出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：（1）整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（2）空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：（1）引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。（3）酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：（1）減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。（2）減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

1.5 PCR的應(yīng)用

PCR技術(shù)自1985年建立以來，發(fā)展迅速，表現(xiàn)出極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值.基于PCR的基本原理，許多學(xué)者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維，對(duì)PCR技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)，使PCR技術(shù)不僅得到了進(jìn)一步地成熟完善，更在此基礎(chǔ)上派生出了許多新的應(yīng)用領(lǐng)域與方法。

PCR技術(shù)首先在基因工程領(lǐng)域有著不可替代的貢獻(xiàn)：
對(duì)DNA片段在按特殊要求進(jìn)行修飾上PCR技術(shù)提供了一種比原有技術(shù)更快更簡(jiǎn)單的方法。因?yàn)榕c重組DNA技術(shù)相比，PCR技術(shù)本身就較為簡(jiǎn)單；而且它還可以通過化學(xué)合成寡聚核苷酸引物的方法更為簡(jiǎn)便地改變DNA的堿基序列，而不需對(duì)DNA片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和連接酶操作；再者，PCR技術(shù)還可能很方便地進(jìn)行序列改造，如在引物5'端加上一個(gè)“添加”序列。此外PCR技術(shù)產(chǎn)生的修飾產(chǎn)物效率幾乎可達(dá)100%。
此外通過PCR引物引入DNA序列變異的原理是非常有用的。最為簡(jiǎn)便的是它可以使PCR產(chǎn)物的一條鏈或另一條鏈或兩條鏈都特異性地標(biāo)記上放射同位素、生物素或熒光素。它還可以在DNA序列的任一位置上特異性地進(jìn)行位點(diǎn)替代、缺失、插入或重組，同時(shí)它還可以將本來毫不相關(guān)的序列準(zhǔn)確地連接起來，并由此獲得可遺傳的突變。
近年來，基于PCR的各種新技術(shù)不斷更新、完善、發(fā)展，如原位PCR技術(shù)、連接酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Ligase chain reaction，LCR）、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)（Transcript-based amplification system，TAS）、標(biāo)記PCR技術(shù)（Labelled Primers，LP-PCR）、彩色PCR技術(shù)（Color Complementation assay PCR，CCAPCR）、反向PCR技術(shù)（reverse PCR）、不對(duì)稱PCR技術(shù)（asymmetric PCR）以及目前熱火朝天的實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（real time PCR）等等，不僅應(yīng)用在科研領(lǐng)域，也在動(dòng)、植物檢疫、食品安全、司法鑒定等社會(huì)生活中的方方面面有著越來越大的應(yīng)用價(jià)值。希望通過自己的努力，使其成為一名玩PCR的高手。

【主要參考書目】
（1）C.W.迪芬巴赫，G.S.德維克斯勒，PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南．科學(xué)出版社：北京，2000
（2）薩姆布魯克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南．第二版．北京：科學(xué)出版社，1998