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基礎(chǔ)理論:本技術(shù)用于評(píng)估T細(xì)胞對(duì)各種刺激的增殖能力。T細(xì)胞增殖能力是反映T細(xì)胞功能的一個(gè)重要指標(biāo)。
刺激T細(xì)胞增殖的因素及意義
1. 特異性抗原: 引起寡克隆活化增殖??擞糜谂袛嗫乖庖叩男Чㄒ呙缃臃N)和回憶反應(yīng)能力,也能反映T細(xì)胞總體的功能。
2. 絲裂原:多克隆。
3. 刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子:多克隆。
T細(xì)胞增殖測(cè)定方法
1. 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2. 放射性核素?fù)饺朐囼?yàn)。
細(xì)胞增殖時(shí),DNA復(fù)制,須從培養(yǎng)液中補(bǔ)充核苷酸。用放射性核素標(biāo)記培養(yǎng)液中提供的胸腺嘧啶(3HTdR),當(dāng)DNA復(fù)制時(shí), 3HTdR摻入正在分裂的細(xì)胞的DNA中。細(xì)胞增殖程度與細(xì)胞內(nèi)摻入的3HTdR的量成正比。通過(guò)用液閃儀定量測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞中的放射性強(qiáng)度,就可以確定T細(xì)胞增殖的能力與強(qiáng)度。
誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖反應(yīng)的絲裂原
1. PHA(植物血凝素)
2. Con A(刀豆蛋白 A)
3. PMN(美洲商陸)
技術(shù)方法
1. 用RPMI-10將PBMC配成1x106/ml的懸液。
2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀釋液。
3.96孔板中選擇一行(共12孔),每孔中加入100μl細(xì)胞。指定每相鄰3孔為一組。前3組分別加入一種稀釋度的PHA溶液,最后一組加培養(yǎng)液(對(duì)照組)。
4. 37°C ,5%CO2,54h。
5. 配制濃度為50μci/ml的3HTdR。
6. 每孔加入50μci 3HTdR,繼續(xù)培養(yǎng)18h。
7.用多孔自動(dòng)收集儀分別收集每孔細(xì)胞于一小管中。溶解細(xì)胞,將DNA過(guò)濾到濾紙上,洗去未摻入的3HTdR,最后用100%的甲醇洗滌,以利濾紙干燥。
8. 將濾紙放入液閃管內(nèi),自動(dòng)計(jì)數(shù),打印結(jié)果。
9. 扣除本底,計(jì)算每一組3個(gè)復(fù)本的平均數(shù)。
影響因素
1. 細(xì)胞活力:冷凍技術(shù)影響細(xì)胞活力,復(fù)蘇后應(yīng)檢查細(xì)胞活力。
2. 培養(yǎng)液中添加的血清:有些血清可能激活或抑制細(xì)胞增殖。如欲測(cè)定人體細(xì)胞增殖能力,可采用滅活的AB血清。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)板類型:根據(jù)細(xì)胞數(shù)量采用不同形狀底部的培養(yǎng)板。
4. 微生物污染:可降低細(xì)胞增殖能力。
原理:T細(xì)胞受體能夠識(shí)別同種異型MHC分子。當(dāng)把2個(gè)不同個(gè)體的單個(gè)核細(xì)胞在體外混合時(shí),可以相互刺激,引起增殖。增殖的強(qiáng)度與兩者之間MHC的差別的程度成正比。所以同種異型混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度反映2個(gè)個(gè)體之間MHC差別的程度,并且因?yàn)橄嗷プR(shí)別與增殖,結(jié)果是2個(gè)個(gè)體的淋巴細(xì)胞增殖能力的總和。這種試驗(yàn)就是雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。
將參加反應(yīng)之一方的單個(gè)核細(xì)胞用放射性核素照射,使其失去反應(yīng)能力,但仍保存刺激能力,成為刺激細(xì)胞,則此時(shí)的反應(yīng)結(jié)果僅反映另一方(反應(yīng)方)的增殖能力。在實(shí)質(zhì)性器官移植時(shí),只需了解受者淋巴細(xì)胞對(duì)供者M(jìn)HC的反應(yīng)能力,所以適合采用單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)。
方法
1. 分離宿主與供者的PBMC,調(diào)整細(xì)胞濃度為1 x 106/ml。
2. 刺激細(xì)胞滅活:用絲裂霉素(終濃度25μg,37 °C, 5%C,30min)或放射性核素照射(2000 rad)的方法處理刺激細(xì)胞。3. 96孔板中,每孔加入1x105的刺激細(xì)胞和1x105反應(yīng)細(xì)胞。 37°C,5%CO2,4~6d。加3HTdR,繼續(xù)培養(yǎng)18h。陽(yáng)性對(duì)照孔加反應(yīng)細(xì)胞和絲裂原,不加刺激細(xì)胞。陰性對(duì)照孔只加照射的自身細(xì)胞。3復(fù)本。
4. 收集細(xì)胞,液閃儀計(jì)數(shù),打印結(jié)果。
5. 計(jì)算相對(duì)反應(yīng)(RR)
(實(shí)驗(yàn)組cpm-陰性對(duì)照組cpm)
RR=—————————————————
陽(yáng)性對(duì)照組cpm-陰性對(duì)照組cpm
注意點(diǎn)
1. 細(xì)胞活力:使用冷凍細(xì)胞時(shí),復(fù)蘇后應(yīng)檢查細(xì)胞活力。
2. 培養(yǎng)液中添加的血清:有的血清可能會(huì)刺激或抑制反應(yīng)。
3. 本底應(yīng)小于2000 rpm,陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)大于20000 rpm。
原理:本試驗(yàn)測(cè)定T細(xì)胞在體外對(duì)某一特定抗原的特異性免疫應(yīng)答能力。所用抗原可以是初次接觸的抗原,也可以是曾經(jīng)免疫過(guò)的抗原。常用的測(cè)定回憶反應(yīng)的抗原有純化蛋白衍生物(PPD)和破傷風(fēng)類毒素(TT)。這2種抗原都被常規(guī)列入計(jì)劃免疫接種范疇,成人應(yīng)該對(duì)它們有回憶反應(yīng)。在某些免疫缺陷病中,對(duì)它們的特異性回憶反應(yīng)可減弱或消失。
方法(以T細(xì)胞對(duì)破傷風(fēng)類毒素刺激的增殖反應(yīng)為例)
1. 分離PBMC和APC,APC用絲裂霉素或放射性核素處理。
2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。
3. 每孔中加入系列稀釋的破傷風(fēng)類毒素溶液,不同孔中抗原終濃度分別為0、1、5、10和20μg/ml。每一種濃度設(shè)3復(fù)本。
4. 37C°,5%CO2,6天。
5. 加3HTdR,繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí),計(jì)數(shù)。
結(jié)果解釋
1. 對(duì)于接種過(guò)破傷風(fēng)疫苗者來(lái)說(shuō),本試驗(yàn)結(jié)果呈低反應(yīng)反映患者對(duì)破傷風(fēng)類毒素特異性應(yīng)答能力低下或全身免疫缺陷。
2. HIV感染者反應(yīng)低下反映CD4+T細(xì)胞減少導(dǎo)致的免疫缺陷。
注意點(diǎn)
1. 培養(yǎng)液中最好用人AB血清。
2. 此T細(xì)胞增殖反應(yīng)需要APC。如使用純化T細(xì)胞,需加5%~10%自身APC。
基礎(chǔ)理論:B細(xì)胞受到多克隆激活劑或特異性抗原刺激后,活化、增殖,最后分化成為漿細(xì)胞,產(chǎn)生抗體??贵w可以在血漿和其他體液中檢出,檢測(cè)抗體是測(cè)定B細(xì)胞功能的最重要的方法。B細(xì)胞分類:B1細(xì)胞和B2細(xì)胞。兩者發(fā)生學(xué)不同、接受刺激的抗原不同,對(duì)T細(xì)胞的依賴性不同。由于B2細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答依賴T細(xì)胞,所以,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的低下,其缺陷也可能起源于T細(xì)胞缺陷。
基礎(chǔ)理論:人B細(xì)胞具有PWM受體,在體外受到PWM刺激時(shí),發(fā)生多克隆激活,產(chǎn)生多克隆抗體。B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力可以用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中抗體的量估計(jì),也可以用ELISPOT方法測(cè)定產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞數(shù)量估計(jì)。
技術(shù)方法與評(píng)價(jià)
1. 分離PBMC96孔板中每孔加入1x105細(xì)胞和PWM終濃度(1:100)。陰性對(duì)照孔內(nèi)不加pWM。每一實(shí)驗(yàn)設(shè)2 復(fù)本。
2. 37C°5%CO2培養(yǎng)10天(ELISA)或7天(ELISPOT)。
3. 收集上清,用ELISA法測(cè)抗體。收集細(xì)胞,用ELISPOT法測(cè)產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。
應(yīng)用實(shí)踐
1. 用于確定B細(xì)胞活化和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,以及細(xì)胞因子和其它銀子對(duì)B細(xì)胞分化的影響。
2. 因?yàn)锽2細(xì)胞產(chǎn)生抗原需要T細(xì)胞輔助,所以又可以用于檢測(cè)T細(xì)胞的輔助功能。
3. 臨床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B細(xì)胞分化異常的機(jī)制。
注意點(diǎn):采用以抗體為基礎(chǔ)的技術(shù)(如磁珠法、淘洗法和流式細(xì)胞儀)分離的B細(xì)胞,需考慮抗體對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的影響(促進(jìn)或抑制作用)。
基礎(chǔ)理論:ELISPOT全稱為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay),可用于測(cè)定產(chǎn)生IgG和IgM抗體的B細(xì)胞。其方法是用抗原包被固相,然后加入抗原特異性B細(xì)胞。如果B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,抗體與板上的抗原結(jié)合。加入酶標(biāo)二抗和顯色劑就會(huì)顯色。一個(gè)斑點(diǎn)就代表一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
技術(shù)方法
1. 抗原包被:37C°2h,或4C°過(guò)夜。固相載體可用聚苯乙烯平皿、亞硝酸纖維膜、96孔板。
2. 抗體生成細(xì)胞培育:加入適量抗體生成細(xì)胞,37C°,5%CO2,3~4h,或過(guò)夜。洗滌,去除為與固相結(jié)合的細(xì)胞。
3. 測(cè)定斑點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞:加二抗, 37C°,5%CO2,2~3h。加辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶和底物顯色。
4 計(jì)數(shù):24h后用10~30倍顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞。
評(píng)價(jià)
1. 在操作中應(yīng)使用無(wú)關(guān)抗原作陰性對(duì)照;病應(yīng)排除細(xì)胞標(biāo)本終抗體污染。
2. 硝酸纖維素膜靈敏度高于聚苯乙烯。
3. 與ELISA聯(lián)合使用,可以估計(jì)單個(gè)細(xì)胞的抗體產(chǎn)量。
4 當(dāng)淋巴細(xì)胞受到嚴(yán)重污染時(shí),也可以使用本法,所以適用于測(cè)定組織中抗體生成細(xì)胞。
應(yīng)用實(shí)踐:用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。
基礎(chǔ)理論:B細(xì)胞受抗原刺激后,最初產(chǎn)生IgM抗體,然后在Th細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子的作用下,可轉(zhuǎn)類成為IgG、IgA、IgE類抗體。應(yīng)用不同的單抗,結(jié)合ELISA方法,可以測(cè)定B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的類別。
方法
1. 包板:96孔板用濃度為10μg/ml的特異性單抗包被。蓋上蓋板,37C°,5%CO2,2h,或4C°過(guò)夜。常規(guī)洗板,封閉。
2. 上樣:每孔內(nèi)加入1:10或1:20 稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μl。陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)品,陰性對(duì)照為培養(yǎng)液。每試驗(yàn)設(shè)2復(fù)本。室溫培育2h,或4C°過(guò)夜。
3. 加酶標(biāo)二抗:每孔加100μl堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室溫培育2h,或4C°過(guò)夜。
4. 顯色:洗板,每孔加100μl底物(p-nitrophenyl phosphate)。
5. 自動(dòng)酶標(biāo)儀讀數(shù),從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出抗體濃度。
評(píng)價(jià):ELISA法靈敏、簡(jiǎn)單、快速、特異性高、重復(fù)性好,是測(cè)定上清和體液中Ig的首選方法。堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗顯色明顯,不必用堿中止反應(yīng),尤其適用于測(cè)定體外產(chǎn)生的抗體。
應(yīng)用實(shí)踐:ELISA可測(cè)定各種體液中的抗體,其結(jié)果反映被檢個(gè)體B細(xì)胞功能。測(cè)定免疫球蛋白各種亞類的水平有助于鑒定免疫缺陷病。
基礎(chǔ)理論:CTL為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的簡(jiǎn)稱。是CD8+T細(xì)胞識(shí)別APC表面MHCI類分子遞呈的腫瘤或病毒特異性抗原肽后,分化形成的。當(dāng)CTL遇到相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞時(shí),能夠通過(guò)細(xì)胞接觸機(jī)制或裂解機(jī)制殺傷靶細(xì)胞。
1. 細(xì)胞接觸機(jī)制
CTL表達(dá)FasL,靶細(xì)胞表達(dá)Fas,F(xiàn)asL與Fas的配接,通過(guò)Fas傳入的信號(hào)激活靶細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。
2. 細(xì)胞裂解機(jī)制
CTL激活后,胞質(zhì)內(nèi)顆粒向2個(gè)細(xì)胞接觸點(diǎn)移動(dòng)。顆粒膜與細(xì)胞膜融合通過(guò)外吐釋放顆粒內(nèi)容物。穿孔素插入靶細(xì)胞膜后聚合,喜愛(ài)細(xì)胞膜上形成孔,造成細(xì)胞裂解。顆粒酶誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。
51Cr標(biāo)記法原理
如在將靶細(xì)胞與CTL混合之前,先用放射性核素51Cr培育,51Cr能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿,與胞漿中小分子蛋白質(zhì)牢固結(jié)合,不能自由從細(xì)胞內(nèi)釋放。當(dāng)靶細(xì)胞膜被CTL破壞后,51Cr被釋放進(jìn)入上清。因?yàn)樯锨逯蟹派湫詮?qiáng)度與細(xì)胞殺傷程度呈正比,通過(guò)測(cè)定上清中放射性強(qiáng)度,就可以判定CTL殺傷能力。
技術(shù)方法
1. 從腫瘤組織中分離淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
2. 51Cr標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。
3.96孔培養(yǎng)板每孔中加入淋巴細(xì)胞和靶細(xì)胞,效:靶比為50:1,25:1,12.5:1。另設(shè)最大釋放對(duì)照(靶細(xì)胞加去污劑)和自發(fā)釋放對(duì)照(不加CTL)。
4. 37C°,5%CO2,4h。
5. 收集上清,?計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性(cpm)。
基礎(chǔ)理論:NK細(xì)胞存在于外周血、淋巴組織中,尤以脾臟最為豐富。因細(xì)胞體積大和胞漿內(nèi)含大量顆粒,故稱大顆粒淋巴細(xì)胞。表型特征是CD16(Fc?RIII A)和CD56(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子)。當(dāng)NK細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞活病毒感染細(xì)胞時(shí),CD16分子被交聯(lián),引起脫顆粒,并分泌IFN-?和TNF。顆粒中含有穿孔素、顆粒酶和proteoglycans,引起靶細(xì)胞溶脹性死亡和凋亡。NK細(xì)胞的CD16與IgG1和IGg3結(jié)合,可介導(dǎo)ADCC作用。
NK細(xì)胞表達(dá)一種能識(shí)別HLA-A、-B、-C抗原的受體,向細(xì)胞發(fā)出一致性信號(hào),阻止NK細(xì)胞的殺傷活性。當(dāng)靶細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)HLAI類分子時(shí),抑制解除,NK細(xì)胞活化,殺傷靶細(xì)胞。
K562細(xì)胞系不表達(dá)HLA分子,對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用敏感,常用作NK細(xì)胞的靶細(xì)胞,用于檢測(cè)NK細(xì)胞的活性。
技術(shù)方法
1. NK細(xì)胞的分離:用抗CD3、CD19、CD14單抗和淘洗法,去除T細(xì)胞、B細(xì)胞和Mo,獲取NK細(xì)胞。
2. 加板: 方法同CTL殺傷試驗(yàn)。不同的是,靶細(xì)胞為K562細(xì)胞。最大釋放組為靶細(xì)胞中加去污劑,自發(fā)釋放對(duì)照組中不加Nk細(xì)胞。37C°,5%CO2,4h。
3. 收集上清液,?計(jì)數(shù)器測(cè)各孔cpm值。
4. 計(jì)算%溶解值:方法同CTL法。
評(píng)價(jià)
1. 本方法穩(wěn)定,但51Cr污染環(huán)境。
2. 從外周血中 分離的NK細(xì)胞是靜止細(xì)胞,只能殺死對(duì)峙敏感的K562細(xì)胞系,不能殺傷其它腫瘤細(xì)胞。
3. 冷凍保存影響NK細(xì)胞活性,故宜采用新鮮分離的NK細(xì)胞。
4. 人血清中含有的IgG會(huì)抑制NK細(xì)胞的殺傷活性,故培養(yǎng)液中宜使用小牛血清。
基礎(chǔ)理論
LAK細(xì)胞是淋巴因子激活殺傷細(xì)胞的簡(jiǎn)稱。NK細(xì)胞在大劑量IL-2刺激下擴(kuò)增并分化成為L(zhǎng)AK細(xì)胞。LAK細(xì)胞對(duì)新鮮分離的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系具有非特異性殺傷作用。臨床上用LAK細(xì)胞過(guò)繼性治療某些腫瘤患者,例如腎細(xì)胞癌、黑色素瘤合霍奇金病,有一定療效。
技術(shù)方法
1.制備:抽取患者外周血20ml,分離PBMC。培養(yǎng)皿中加入重組IL-2,是終濃度為100U/ml。37C°,5%CO2,培養(yǎng),每3~4天換液;細(xì)胞數(shù)增加時(shí)分瓶。
2.培養(yǎng)7~10天。收集細(xì)胞,計(jì)數(shù)。細(xì)胞需要量為109~1010。
3.LAK細(xì)胞毒性檢測(cè):方法同NK細(xì)胞毒性檢測(cè),不同的是,本方法使用的靶細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞系 Daudi細(xì)胞。
應(yīng)用實(shí)踐
1.用于檢測(cè)NK細(xì)胞的功能:正常人NK細(xì)胞在大劑量IL-2作用下能夠分化成為L(zhǎng)AK細(xì)胞。NK細(xì)胞功能缺陷者,分化能力降低。檢測(cè)LAK細(xì)胞活性可以作為衡量NK細(xì)胞功能活性的指標(biāo)。
2.檢測(cè)LAK細(xì)胞的細(xì)胞毒性:預(yù)測(cè)LAK細(xì)胞功能活性。