SARS-CoV-2是一種有包膜的單鏈RNA 病毒，病毒RNA通過核糖體移碼產(chǎn)生兩個多聚蛋白：pp1a和pp1ab。多蛋白由木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PL pro）處理，其切割3個位點釋放非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1-3和一種3C樣蛋白酶，也稱為主要蛋白酶（M pro）。在11個位點切割以釋放非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白形成復(fù)制酶復(fù)合體，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因此使得M pro和PL Pro成為抗病毒藥物開發(fā)的主要目標(biāo)。
結(jié)構(gòu)生物學(xué)可以起到藥物開發(fā)的關(guān)鍵作用，但直接靶向SARS-CoV-2的藥物仍然令人難以捉摸。近日，《Nature Communications》上的一篇新論文概述了一個國際研究團(tuán)隊如何確定潛在的方法，以快速設(shè)計出與COVID-19對抗的改進(jìn)且功能更強的化合物。研究人員通過結(jié)合質(zhì)譜和X射線方法對SARS-CoV-2主蛋白酶進(jìn)行了大規(guī)模的親電試劑和非共價片段篩選病毒復(fù)制，晶體學(xué)屏幕確定了覆蓋整個活動位點的71個匹配以及二聚體界面的3個匹配。這些組合提供了前所未有的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性信息，可用于正在進(jìn)行的針對SARS-CoV-2主蛋白酶結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計。
Part 1
M pro以無配體形式結(jié)晶，衍射至接近原子分辨率
不含配體的M pro的晶體結(jié)構(gòu)適合X射線片段篩選（來源：Nature Communications）
晶體形式非常適合晶體碎片篩查，盡管蛋白晶體的溶劑百分比非常低，但是仍然存在清晰的通道可以通過擴(kuò)散進(jìn)入活性位點。此外，當(dāng)向結(jié)晶液滴中添加可溶解的碎片時，緊密堆積和牢固的先天衍射平均晶體可抵抗晶格破壞和DMSO溶劑對衍射的降解。
Part 2
結(jié)合MS和晶體學(xué)碎片篩查揭示了M pro的新結(jié)合劑
結(jié)晶碎片屏幕的時間線（來源：Nature Communications）
為了確定共價起點，研究人員使用完整蛋白質(zhì)譜法篩選了先前描述的針對Mpro的約1000個輕度親電片段庫。含有化合物N-（chloroacetyl）aniline基序是頻繁擊打者，因為這樣的化合物是高反應(yīng)性的。因此，研究人員選擇反應(yīng)性相對較低的系列成員進(jìn)行后續(xù)結(jié)晶嘗試，對于包含N-氯乙?；哙せ?4-羧酰胺基序的另一系列命中化合物，它們顯示較低的反應(yīng)性并且在以前的篩選中不經(jīng)常發(fā)生擊打。
雖然溫和的親電片段非常適合探測活性位點半胱氨酸周圍的結(jié)合特性，但它們的小尺寸卻阻止了對底物結(jié)合的廣泛探索。研究人員進(jìn)行了另一次晶體學(xué)碎片篩查，以詳盡地探查Mpro活性位點，并尋找碎片合并或生長的機會。將68個親電子片段命中以及來自7個文庫的總共1176個獨特片段添加到晶體中，非共價片段被浸泡，而親電試劑片段既被浸泡又被共結(jié)晶，以確保在結(jié)構(gòu)上觀察到盡可能多的質(zhì)譜圖?？偣?742次浸泡和1139次共結(jié)晶實驗產(chǎn)生了1877個鑲嵌晶體，盡管有些碎片破壞了晶體或衍射，但仍然收集到了1638個分辨率高于2.8?的數(shù)據(jù)集。
Part 3
非共價片段命中揭示了活性位點中的多個可靶向亞位點
研究人員共鑒定出八個片段結(jié)合在S1亞位點上，并通過吡啶環(huán)或類似的含氮雜環(huán)與關(guān)鍵殘基的側(cè)鏈形成相互作用，通過酰胺或脲部分中的羰基與Glu166形成相互作用。與其他亞位點相比，亞位點S2先前已顯示出更大的靈活性，可適應(yīng)肽基抑制劑中較小的取代基，但會優(yōu)先選擇亮氨酸或其他疏水殘基。許多片段在此位置結(jié)合，研究人員稱其為“芳香輪”，是因為芳香環(huán)的一致基序與Met49形成疏水相互作用，或與His41形成π-π堆積，基團(tuán)分別在4個軸向上放置。
結(jié)合的片段對活動位點進(jìn)行了全面采樣（來源：Nature Communications）
在探索亞位點S3的四個片段中，其中三個片段帶有一個磺酰胺基的芳環(huán)，該磺酰胺基與Gln189形成氫鍵，并朝著溶劑界面指向活性位點，這些命中具有適合利用上述相同的His164 / Met165 / Asp187口袋的擴(kuò)展載體。
已經(jīng)確定，對于類似的病毒蛋白酶如SARS-CoV的-1蛋白酶的生物學(xué)單元是二聚體，并且在突變二聚體界面可以破壞蛋白酶活性，因此干擾二聚化的化合物可能充當(dāng)?shù)鞍酌富钚缘臏?zhǔn)變構(gòu)抑制劑。在這項研究中，三種化合物結(jié)合在二聚體界面的可及位置，可以想象到利用它們來設(shè)計化合物來破壞M pro二聚體。
二聚體界面的片段表示變構(gòu)調(diào)節(jié)的機會（來源：Nature Communications）
片段Z1849009686（×1086）結(jié)合在由Met6、Phe8、Arg298和Val303的側(cè)鏈形成的疏水口袋中，它還介導(dǎo)了兩個氫鍵與Gln127的側(cè)鏈和Met6的骨架。Z264347221（×1187）類似地結(jié)合在由Met6，Phe8和Arg298制成的疏水性口袋中，延伸穿過二聚體界面以與第二個原發(fā)性蛋白的Ser123、Tyr118和Leu141相互作用，包括氫鍵Ser123的側(cè)鏈和主干。最后是POB0073（x0887），在二聚體界面處僅與Gly2結(jié)合4?，被包裹在一個前體的Lys137和Val171之間，而另一個包裹在Gly2、Arg4、Phe3、Lys5和Leu282之間，包括兩個與Phe3骨架相連的氫鍵。
Part 4
共價片段命中揭示了幾個易處理的系列
在所有具有親電試劑結(jié)合的結(jié)構(gòu)中，N-氯乙酰基羰基氧原子與Gly143、Ser144或Cys145的骨架酰胺氫形成兩個或三個氫鍵，包含N-氯乙?；哙せ?4-羧酰胺基序的所有三種化合物都采用類似的指向S2口袋的結(jié)合方式。
共價片段錨定在Cys145處并取樣正構(gòu)M pro結(jié)合袋的不同區(qū)域（來源：Nature Communications）
一系列含有N-氯乙?；哙せ?4-羧酰胺基序的化合物顯示出了有前途的結(jié)合模式。為了跟蹤這些化合物，研究人員進(jìn)行了第二代化合物的快速合成。通過N-氯乙酰基哌啶-4-羰基氯與各種內(nèi)部胺（優(yōu)選帶有發(fā)色團(tuán)以簡化純化）的反應(yīng)，可以以毫克級獲得這種化學(xué)型的衍生物。這些新化合物通過完整蛋白質(zhì)質(zhì)譜法測試，以評估蛋白質(zhì)標(biāo)記。源自非極性胺的酰胺大多勝過其極性對應(yīng)物，這暗示了在該方向上可靶向的親脂性亞區(qū)域。兩種具有最高標(biāo)記的PG-COV-35和PG-COV-34的酰胺突出顯示了分別通過酰胺N-烷基化或交叉偶聯(lián)進(jìn)一步合成衍生化的潛力。
突出顯示的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系對于進(jìn)一步優(yōu)化很重要。溴炔具有固有的硫醇反應(yīng)性，它比已建立的基于丙烯酰胺的共價抑制劑的固有硫醇反應(yīng)性低。炔烴的幾何形狀及其結(jié)合方式也表明，可以用可逆的共價基團(tuán)（例如腈）代替，它可以通過相同的非共價相互作用進(jìn)行引導(dǎo)。兩個共價命中物（2-氰基嘧啶和2-氰基咪唑）來自小型雜環(huán)親電子試劑庫，它們實質(zhì)上是由五元和六元氮組成，含具有吸電子特性的雜環(huán)，可激活小的親電子取代基（鹵素，乙基，乙烯基和腈基）。
Part 5
結(jié)果與討論
本研究提供的數(shù)據(jù)為從SARS-CoV-2開發(fā)有效的M pro抑制劑提供了許多明確的途徑。結(jié)合的片段全面采樣了活性位點的所有子位點，揭示了不同的擴(kuò)增載體，并且親電試劑為設(shè)計共價化合物提供了系統(tǒng)的和偶然的廣泛數(shù)據(jù)。人們普遍認(rèn)為，新的小分子藥物不能以足夠快的速度開發(fā)出來以幫助對抗COVID-19。然而，由于大流行病威脅仍將是一個長期問題，并且候選疫苗不能保證提供全面和持久的保護(hù)，因此抗病毒分子將仍然是重要的防御線，這類化合物還需要與未來的流行病作斗爭，此項研究得出的數(shù)據(jù)將加速此類工作進(jìn)展。
總的來說，共價命中提供了低反應(yīng)性和高選擇性抑制劑的合理途徑。合理設(shè)計的共價藥物獲得牽引力，許多最近FDA批準(zhǔn)的藥物，它們的設(shè)計是基于非常有效的非共價結(jié)合，即允許低反應(yīng)性親電的精確定位，所以共價鍵的形成即是結(jié)合位點特異性的依賴。碎片方法已成為現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)的一種主要方法，使用了少量化合物（ < 300Da）的小集合 （100s或1000s ），這些化合物雜亂地結(jié)合在一起，因此比HTS獲得的化學(xué)空間要大得多。面臨的挑戰(zhàn)是，片段擊中的結(jié)合非常弱，需要高度靈敏的生物物理檢測，對結(jié)合的仔細(xì)確認(rèn)以及專業(yè)的化學(xué)知識才能將這些擊中并發(fā)展為完全有效的候選藥物。但真正的希望是可以將它們快速有效地轉(zhuǎn)化為有效的候選藥物，并通過更簡單的途徑將其轉(zhuǎn)化為臨床藥物。
世界上的焦點一直放在疫苗和現(xiàn)有藥物的再利用上，但是該項研究是少數(shù)嘗試新型小分子療法的項目之一。該研究團(tuán)隊采取了極為不同尋常的途徑，即在生成所有實驗數(shù)據(jù)后立即將其發(fā)布，因此結(jié)果將可供全球任何一家藥品制造商使用。國際社會對此項研究數(shù)據(jù)實時發(fā)布的反應(yīng)更為出色，紛紛調(diào)動了大量的專業(yè)知識、技術(shù)和慈善事業(yè)，并演變成一種獨特而嚴(yán)格的藥物發(fā)現(xiàn)工作旨在迅速開發(fā)出具有良好安全性和臨床前特性的的口服抗病毒藥物。美迪西作為新藥研發(fā)CRO也會持續(xù)關(guān)注此項研究進(jìn)展。
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