11月29日，美迪西臨床前毒理研究部副總裁曾憲成博士在基因治療系列公開(kāi)課【第4期】中做了主題為《對(duì)基因治療產(chǎn)品非臨床研究策略的思考》的報(bào)告，本文根據(jù)專家報(bào)告內(nèi)容整理，并經(jīng)專家審核確認(rèn)。

嘉賓簡(jiǎn)介

曾憲成博士，美迪西臨床前毒理研究部副總裁
高級(jí)工程師，2010年在上海醫(yī)藥工業(yè)研究院獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，2010-2013年在國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心工作，在此期間被派往國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心進(jìn)行新藥審評(píng)理論和技術(shù)培訓(xùn)和實(shí)踐；2013年加入美迪西普亞醫(yī)藥科技（上海）有限公司，現(xiàn)任毒理研究部副總裁，從事生物技術(shù)藥物、疫苗及化學(xué)藥品一般毒性試驗(yàn)研究并承擔(dān)毒理研究部團(tuán)隊(duì)管理工作。作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人完成了20個(gè)1類化藥、8個(gè)抗體偶聯(lián)藥物、10個(gè)單克隆抗體、2個(gè)激素藥物、2個(gè)預(yù)防用疫苗及1個(gè)復(fù)方藥物申報(bào)中國(guó)和/或美國(guó)整套的一般毒性和藥代動(dòng)力學(xué)研究。作為課題負(fù)責(zé)人承擔(dān)了上海市科委資助的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)研究2項(xiàng)，作為子課題負(fù)責(zé)人參與了“十一五”國(guó)家新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)研究。

GT產(chǎn)品與核酸藥物的關(guān)系

若按照藥物結(jié)構(gòu)分類，部分GT產(chǎn)品其實(shí)也屬于核酸藥物，比如使用非病毒載體遞送的GT產(chǎn)品。核酸藥物由于它本身獨(dú)特的物理化學(xué)和藥理學(xué)特點(diǎn)，屬于新的臨床治療藥物種類，為人類提供了藥物研究的新領(lǐng)域。

小分子藥物，蛋白藥物或抗體藥物是當(dāng)前主要的臨床治療藥物類型，靶點(diǎn)主要是蛋白質(zhì)，比如酶類，受體，離子通道，轉(zhuǎn)運(yùn)體和激酶等。但尋找一個(gè)新的靶點(diǎn)，并開(kāi)發(fā)成藥物仍然是困難重重。

在罕見(jiàn)病領(lǐng)域，常規(guī)藥物難以發(fā)揮作用，但或許可以依賴GT產(chǎn)品解決。核酸藥物目前主要的應(yīng)用領(lǐng)域是在單基因干擾，而且比較多的罕見(jiàn)病屬于單基因異常，NIH報(bào)告目前有7000種罕見(jiàn)病，其中約80%是單基因異常，半數(shù)病例為兒童，而95%尚無(wú)治療手段；對(duì)于多基因異常的疾病，核酸藥物是不是能發(fā)揮一定的作用尚待研究。

當(dāng)前核酸藥物治療分為三個(gè)主要方向：補(bǔ)充基因突變失去的功能（如導(dǎo)入正?；虻寞煼ǎ灰种苹虺聊惓；颍ㄈ鏡NA干擾療法）；直接糾正異?；蚪Y(jié)構(gòu)（如基因編輯療法）。

GT產(chǎn)品概念

基因治療產(chǎn)品一般通過(guò)將外源基因（或基因編輯工具）導(dǎo)入靶細(xì)胞或組織，替代、補(bǔ)償、阻斷、修正、增加或敲除特定基因以發(fā)揮治療作用。按照基因?qū)肴梭w的方式不同，基因治療可分為體內(nèi)（in vivo）基因?qū)牒腕w外（ex vivo）基因?qū)雰煞N方式。

體內(nèi)基因治療產(chǎn)品將外源基因（或基因編輯工具）通過(guò)適當(dāng)?shù)妮d體直接導(dǎo)入人體發(fā)揮治療作用，而體外基因治療產(chǎn)品一般在體外將外源基因（或基因編輯工具）導(dǎo)入細(xì)胞，制備成為經(jīng)基因修飾的細(xì)胞或細(xì)胞衍生產(chǎn)品，最終經(jīng)回輸以發(fā)揮治療作用。（NMPA，《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行），2022.05）

圖1 四種經(jīng)典/常見(jiàn)基因治療策略

GT產(chǎn)品遞送系統(tǒng)

對(duì)GT產(chǎn)品來(lái)講，遞送系統(tǒng)是它研究的一個(gè)重要方面，到目前為止還沒(méi)有一個(gè)非常理想的遞送系統(tǒng)。目前GT產(chǎn)品常用的遞送系統(tǒng)可以分為病毒和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體系統(tǒng)目前用的比較多的有逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒，腺病毒（免疫原性較強(qiáng)）和腺相關(guān)病毒等。非病毒載體主要有脂質(zhì)納米粒等。

病毒和非病毒載體進(jìn)入細(xì)胞方式、特點(diǎn)及其后續(xù)命運(yùn)決定了組織分布必會(huì)成為這類藥物研究的重點(diǎn)。另外一方面，應(yīng)該選擇什么動(dòng)物種屬？?jī)煞N載體進(jìn)入細(xì)胞的方式，轉(zhuǎn)基因從內(nèi)吞小體的釋放，入細(xì)胞核方式，后續(xù)的轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程等都是試驗(yàn)動(dòng)物種屬相關(guān)性考慮的重點(diǎn)。另外還要考慮相關(guān)種屬解剖結(jié)構(gòu)（比如大腦和脊髓解剖結(jié)構(gòu)、組織尺寸大小及功能方面；大動(dòng)物，如猴和豬，比大鼠更接近人，尤其是病毒載體，因?yàn)椴《緜鞑ヒ粋€(gè)重要途徑是通過(guò)神經(jīng)。）

相關(guān)動(dòng)物種屬的選擇還應(yīng)該考慮以下方面：藥效靶器官被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)；載體安全性已知；轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平與人體可比性；該種屬動(dòng)物可以呈現(xiàn)該疾病狀態(tài)；動(dòng)物對(duì)基因修飾細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)反應(yīng)與預(yù)期的人體反應(yīng)的相似性；動(dòng)物對(duì)異種來(lái)源的基因修飾細(xì)胞的免疫耐受性；動(dòng)物病理生理學(xué)特征與擬用患者人群的相似性；臨床擬用遞送/給藥方式的可行性。

圖2 當(dāng)前常用病毒/非病毒載體特點(diǎn)比較

正因?yàn)椴《据d體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄，有整合到基因組的風(fēng)險(xiǎn)，所以使用病毒載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的GT產(chǎn)品通常要評(píng)估致癌性。所以對(duì)于基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，致癌性的評(píng)估在指導(dǎo)原則中又被放到非常醒目的位置。

2021年《基因治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中對(duì)致癌性的評(píng)估要求有以下幾點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物致癌性試驗(yàn)一般不適于評(píng)價(jià)基因治療產(chǎn)品?？刹捎米C據(jù)權(quán)重（Weight of Evident, WoE）方法來(lái)評(píng)估致癌風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)進(jìn)行致癌性研究。WoE關(guān)注因素一般包括但不限于：藥物靶點(diǎn)和藥理作用通路與致癌性相關(guān)（例如導(dǎo)入基因產(chǎn)物是生長(zhǎng)因子）；靶點(diǎn)和信號(hào)通路的藥理作用特征預(yù)測(cè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有一定相關(guān)性。插入突變研究的相關(guān)結(jié)果提示有致癌風(fēng)險(xiǎn)。載體設(shè)計(jì)中有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)；生產(chǎn)體系中存在引入致癌成分。一般毒理學(xué)試驗(yàn)組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，包括彌漫性和/或局灶性細(xì)胞增生、持續(xù)的組織損傷和/或慢性炎癥，癌前病變和腫瘤發(fā)生；激素紊亂。免疫抑制等。目前對(duì)基因修飾的細(xì)胞產(chǎn)品，除要進(jìn)行上述致癌性評(píng)估外，還需要進(jìn)行成瘤性評(píng)價(jià)。

病毒載體系統(tǒng)胞內(nèi)作用過(guò)程

以病毒為載體的基因治療產(chǎn)品在體內(nèi)的發(fā)生過(guò)程如圖3。AAV的細(xì)胞表面黏附由初級(jí)糖鏈?zhǔn)荏w介導(dǎo)，并由蛋白質(zhì)類次級(jí)受體穩(wěn)定。然后以AAV為基礎(chǔ)的載體在通往細(xì)胞核的過(guò)程中利用多種內(nèi)吞途徑。隨后RAAV衣殼在分選室(內(nèi)小體和高爾基體)中經(jīng)歷了實(shí)質(zhì)性的構(gòu)象變化。在逃離分選室后，載體粒子聚集在核周空間，并通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，載體基因組被釋放和轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

圖3 以AAV病毒載體為例
經(jīng)典的基因治療產(chǎn)品體內(nèi)過(guò)程

GT產(chǎn)品非臨床研究策略

如圖4顯示的是GT產(chǎn)品進(jìn)行非臨床評(píng)價(jià)項(xiàng)目一般策略。藥理學(xué)研究方面需要做動(dòng)物模型有效性研究，概念驗(yàn)證及安全藥理；藥代動(dòng)力學(xué)的研究則要重點(diǎn)研究暴露量，生物分布及脫落研究；毒理學(xué)方面要做一般毒理學(xué)，免疫原性，免疫毒性，遺傳生殖毒性，致癌性，局部耐受性和病毒脫落風(fēng)險(xiǎn)（尤其是復(fù)制型病毒）研究。

圖4 基因治療產(chǎn)品要進(jìn)行的非臨床評(píng)價(jià)項(xiàng)目

除此之外，2017年歐盟、美國(guó)、日本等三個(gè)政府或經(jīng)濟(jì)聯(lián)合體在Yale Journal of Biology and Medicine上發(fā)表文章推薦基因治療產(chǎn)品非臨床安全研究要關(guān)注以下問(wèn)題：制劑組分引起的毒性（比如脂質(zhì)體不同組分及其它污染物，輕則產(chǎn)生免疫原性重則會(huì)致癌），給藥途徑引起的毒性（局部用藥還是系統(tǒng)用藥），非靶細(xì)胞/組織異常分布（脫靶問(wèn)題），載體及轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)及其表達(dá)水平（直接決定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)據(jù)的價(jià)值），非靶細(xì)胞/組織病毒復(fù)制水平，免疫激活和抑制，針對(duì)載體的免疫反應(yīng)，靶細(xì)胞活化狀態(tài)/表型，潛在的插入突變/致癌，潛在的生殖器官傳播，潛在的由患者向家庭成員及照料者的水平傳播（如脫落）等。

GT產(chǎn)品免疫原性產(chǎn)生過(guò)程

GT產(chǎn)品的病毒/非病毒載體遞送的是核酸。在機(jī)體漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中衍生了一系列識(shí)別外來(lái)物質(zhì)的系統(tǒng)或通路，如模式識(shí)別受體。當(dāng)核酸被模式識(shí)別受體識(shí)別后先會(huì)引起先天性免疫反應(yīng)，這也正是我們要關(guān)注的基因治療產(chǎn)品給藥之后引起的早期/急性毒性反應(yīng)。無(wú)論病毒還是非病毒載體，由于遞送內(nèi)容化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，會(huì)共用相同識(shí)別系統(tǒng)，最后產(chǎn)生相似的生物學(xué)效應(yīng)，如產(chǎn)生I型干擾素，II型干擾素，細(xì)胞因子等。同時(shí)為后期激活適應(yīng)性免疫做鋪墊。后期產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫主要分為細(xì)胞免疫和體液免疫，體液免疫是針對(duì)病毒的衣殼，或病毒衣殼被降解之后的產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物等外來(lái)物質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。如果是細(xì)胞治療產(chǎn)品，本身就會(huì)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)。病毒載體免疫原性來(lái)源分析如圖5。

圖5 病毒載體免疫原性來(lái)源分析

在做非臨床毒性研究時(shí)要重點(diǎn)關(guān)注先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，常用ELISA，qPCR，ELISpot等方法監(jiān)測(cè)，有時(shí)候需要對(duì)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行中和抗體屬性鑒定時(shí)候會(huì)采用一些干擾活性潛能研究的方法。

當(dāng)我們獲悉了免疫原性來(lái)源之后將會(huì)增加對(duì)指導(dǎo)原則相應(yīng)條款及要求的理解。指導(dǎo)原則中提到：基因治療產(chǎn)品可能導(dǎo)致的免疫反應(yīng)包括先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。多種因素可顯著影響基因治療產(chǎn)品的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，如宿主因素（前期接觸過(guò)相關(guān)病毒血清型和/或?qū)牖虍a(chǎn)物，免疫系統(tǒng)狀態(tài)）、基因遞送方式（遞送系統(tǒng)種類、給藥途徑和靶組織）、載體（載體種類、血清型、劑量和導(dǎo)入基因的調(diào)控原件類型等）、導(dǎo)入基因的產(chǎn)物、異位表達(dá)基因產(chǎn)物（特別是針對(duì)免疫豁免器官和/或部位特異性表達(dá)的基因產(chǎn)物）?；蛑委煯a(chǎn)品的免疫原性可能來(lái)源于產(chǎn)品中的非人源化組分、導(dǎo)入基因的表達(dá)產(chǎn)物、載體、基因編輯產(chǎn)生的非預(yù)期的肽/蛋白質(zhì)等。病毒載體類基因治療產(chǎn)品相對(duì)更容易產(chǎn)生免疫原性。此外，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物預(yù)存免疫對(duì)試驗(yàn)的影響。

當(dāng)前控制病毒載體免疫原性策略

既然免疫原性不可避免，可以做一些消除免疫原性影響的工作。常見(jiàn)策略是使用藥物干預(yù)而實(shí)現(xiàn)免疫抑制。目前研究文獻(xiàn)中也有提到其他方式，如通過(guò)控制劑量并利用肝臟獨(dú)特的不活躍的免疫環(huán)境，或利用AAV-CAR Tregs來(lái)控制病毒載體的免疫原性。(Frontiers Immunology,2020:11;Molecular Therapy: Methods & Clinical Development,2021:23)。除上述提到的控制免疫原性的策略之外，還有諸多其他不同的方式。這主要是提醒我們，要關(guān)注到預(yù)存抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，如果研究這類產(chǎn)品，沒(méi)有做預(yù)存抗體篩選，注定實(shí)驗(yàn)結(jié)果多數(shù)情況下會(huì)失敗或無(wú)申報(bào)價(jià)值。

病毒載體組織分布及排出/脫落（shedding）研究重點(diǎn)要關(guān)注大腦，兩大傳播途徑，即血液和神經(jīng)等；除此之外還要關(guān)注在生殖系統(tǒng)有沒(méi)有分布。了解上述內(nèi)容之后，關(guān)于指導(dǎo)原則對(duì)生物分布（含排出/脫落）研究的規(guī)定就更容易理解了。在生殖毒性研究方面，基因治療產(chǎn)品應(yīng)根據(jù)受試者的產(chǎn)品類型、作用機(jī)制、一般毒理發(fā)現(xiàn)、生物分布特征以及患者人群來(lái)評(píng)估潛在的生殖/發(fā)育毒性風(fēng)險(xiǎn)。如果基因治療產(chǎn)品擬用于有生育可能或妊娠人群，應(yīng)研究產(chǎn)品對(duì)胎兒的影響（例如細(xì)胞因子局部生成后通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)），開(kāi)展胚胎-胎仔發(fā)育和圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)。如果在一般毒理學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有潛在的生殖器官毒性反應(yīng)，應(yīng)開(kāi)展生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)。當(dāng)基因治療產(chǎn)品在生殖器官持續(xù)存在時(shí)，需要進(jìn)一步確定其在生殖細(xì)胞（例如卵母細(xì)胞、精子）的暴露水平。

總結(jié)

當(dāng)前GT治療產(chǎn)品在以下幾個(gè)方面存在挑戰(zhàn)：

1. 在實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)/安排方面，長(zhǎng)周期的毒性研究（如6個(gè)月毒性試驗(yàn)）是否總是需要；選擇毒性試驗(yàn)劑量的最好方法；若有免疫原性，進(jìn)行毒性研究的最好方式；生物分布研究需要采集多少組織；如果采用相同的病毒衣殼及增強(qiáng)子或相同的脂質(zhì)納米粒遞送系統(tǒng)，但轉(zhuǎn)基因不同，是否仍需要進(jìn)行生物分布研究；如果已有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)證明低風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于低/不整合的載體是否仍有必要進(jìn)行整合性研究；

2. 研究數(shù)據(jù)分析方面，動(dòng)物體生物分布/表達(dá)/不良反應(yīng)如何外推至人；歷史數(shù)據(jù)缺乏；

3. 不同方法間、同一家公司不同場(chǎng)所間、公司和外包生產(chǎn)商間、外包生產(chǎn)商批次間等產(chǎn)品間質(zhì)量一致性方面，什么樣的體外比對(duì)研究已經(jīng)可以充分說(shuō)明可比性；多大的產(chǎn)品不同會(huì)導(dǎo)致額外毒性研究；何時(shí)及需要哪些研究以研究清楚差異的影響；

4. 后期開(kāi)發(fā)方面，需要哪些研究以支持有妊娠需求婦女用藥；

5. 監(jiān)管方面，某些方面在不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)間尚未達(dá)成一致；晚期開(kāi)發(fā)如何進(jìn)行缺乏清晰的指導(dǎo)原則（如生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)及致癌性試驗(yàn)策略）（Molecular Therapy: Methods & Clinical Development,2020 ）。

直播預(yù)告

12月20日20:00-21:30

基因治療公開(kāi)課（第5期）將開(kāi)始直播

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