化合物活性篩選中心篩選模型

2015-10-22

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美迪西藥物化學(xué)服務(wù)項目

美迪西與國內(nèi)外客戶已完成了數(shù)十個藥物研發(fā)合作項目，并已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)多個臨床前候選藥物。美迪西藥物化學(xué)團(tuán)隊能為客戶提供如下服務(wù)：
新藥靶標(biāo)的可行性評估
高通量篩選和基于結(jié)構(gòu)設(shè)計的活性化合物發(fā)現(xiàn)
活性化合物到先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)
先導(dǎo)化合物的優(yōu)化到臨床前候選藥物的確定
計算機(jī)輔助藥物設(shè)計
構(gòu)效關(guān)系研究

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1、抗腫瘤（抗炎）藥物活性篩選

主要模型：

a、體外腫瘤細(xì)胞毒篩選模型
b、體內(nèi)抗腫瘤藥效評價模型（裸鼠移植瘤）
c、一氧化氮（NO）生成抑制劑篩選
d、NF-κ B 信號通路抑制劑篩選
e、wnt 信號通路抑制劑篩選
f、蛋白酶體抑制劑篩選模型
e、Iκ B 激酶-β (IKK-β )抑制劑篩選模型
f、微管蛋白聚合解聚篩選模型
g、組蛋白去乙?；敢种苿┖Y選模型

藥物活性篩選

篩選模型名稱	主要應(yīng)用
a、體外腫瘤細(xì)胞毒篩選模型	該模型可用于評價化合物對體外腫瘤細(xì)胞生長及增殖的抑制活性，也可用來指導(dǎo)精制組分中的抗腫瘤活性單體的追蹤分離，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可高通量進(jìn)行。
b、體內(nèi)抗腫瘤藥效評價模型（裸鼠移植瘤）	該模型廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物研發(fā)，是抗腫瘤藥物研發(fā)中的重要環(huán)節(jié)，結(jié)果綜合反映藥物的體內(nèi)作用效果，為評價化合物的成藥性提供重要的數(shù)據(jù)。
c、一氧化氮（NO）生成抑制劑篩選	該模型直接評價化合物抑制 NO 生成的活性，適合通量篩選，快速，靈敏?？赏ㄟ^預(yù)刺激確證化合物是否作用于 NF-κ B 信號通路，為進(jìn)一步作用機(jī)制的研究提供線索。
d、NF-κ B 信號通路抑制劑篩選	該模型應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)直接檢測化合物對 NF-κ B 信號通路的抑制作用，方法直接、靈敏，檢測結(jié)果是化合物是否作用于信號通路的直接判斷依據(jù)。
e、wnt 信號通路抑制劑篩選	該模型應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)直接檢測化合物對 wnt/β -catenin信號通路的抑制作用，檢測快速，靈敏度高，可高通量進(jìn)行。
f、蛋白酶體抑制劑篩選模型	該模型針對蛋白酶體復(fù)合物的核心 20S 催化顆粒進(jìn)行篩選，可直接評價化合物對蛋白酶體的抑制活性，檢測靶點明確，快速，靈敏度高。
e、Iκ B 激酶-β (IKK-β )抑制劑篩選模型	該模型直接檢測化合物對 IKK-β 激酶的抑制作用，應(yīng)用熒光比色的方法，檢測靶點明確，快速，靈敏度高。
f、微管蛋白聚合解聚篩選模型	該模型通過熒光比色直接針對微管蛋白的聚合和解聚過程進(jìn)行檢測，檢測靶點明確，方法快速，靈敏度高。
g、組蛋白去乙酰化酶抑制劑篩選模型	該模型通過熒光比色直接檢測化合物抑制 HDAC 的活性，檢測靶點明確，方法快速，靈敏度高。

2、神經(jīng)系統(tǒng)藥物活性篩選

主要模型：

a、乙酰/丁酰膽堿酯酶（AChE/ BuChE）抑制活性篩選模型

b、促進(jìn) PC12 細(xì)胞化活性篩選模型
c、鈣流活性篩選模型
d、線蟲長壽模型 I
e、線蟲長壽模型 II
f、抗腦缺血藥藥效檢測
g、抗老年癡呆藥藥效檢測
h、抗癲癇藥藥效檢測
i、抗抑郁藥藥效檢測模型

篩選模型名稱	主要應(yīng)用
a、乙酰/丁酰膽堿酯酶（AChE/ BuChE）抑制活性篩選模型	該模型以他克林（膽堿酯酶抑制劑）作為陽性對照，化合物與乙酰/丁酰膽堿酯酶的混合液在 30℃反應(yīng)，乙酰/丁酰膽堿酯酶能夠催化其底物類似物碘化硫代乙酰/丁酰膽堿降解，生成硫代膽堿和乙酸/丁酸，反應(yīng)生成物與顯色劑 DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在 405nm 處有特異光吸收。如果化合物對乙酰/丁酰膽堿酯酶有抑制作用，那么乙酰/丁酰膽堿酯酶催化底物類似物碘化硫代乙酰/丁酰膽堿降解的量就會減少，相應(yīng)的與 DTNB 反應(yīng)生成的黃色化合物減少，即在 405nm處的光吸收值變小，以此來篩選具有抑制活性的化合物。
b、促進(jìn) PC12 細(xì)胞化活性篩選模型	該模型以未分化的PC12細(xì)胞為實驗對象，采用包被培養(yǎng)方式，以NGF為陽性對照，化合物溶媒作為對照組，誘導(dǎo)72h后，顯微鏡下觀察并記錄PC12細(xì)胞分化情況，統(tǒng)計分析細(xì)胞分化率（軸索長度≥細(xì)胞直徑的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)）、具有軸索的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞平均軸索數(shù)、梭形細(xì)胞比例等細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)參數(shù)，以此篩選出具有促進(jìn)PC12細(xì)胞分化活性的化合物。
c、鈣流活性篩選模型	該模型以細(xì)胞為檢測對象，使用離子指示劑 Fluo 4-AM 作為細(xì)胞內(nèi) Ca2+的測定技術(shù)。Fluo 4-AM 是 Fluo 4 的一種乙酰甲酯衍生物（AM），通過培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞中。AM 進(jìn)入細(xì)胞后會被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生 Fluo 4，未結(jié)合的 Fluo 4 熒光很弱，與游離的鈣離子(Ca2+)結(jié)合后產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。使用 Thermo Scientific 高內(nèi)涵藥物篩選儀，激發(fā)光 485nm，5s 檢測一次，持續(xù)檢測 5min，以熒光的變化來判定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，從而評價化合物的鈣流活性，為下一步的作用機(jī)制研究提供線索。
d、線蟲長壽模型 I	該模型以 TJ356 線蟲株為實驗對象，TJ356 是 daf-16::GFP 轉(zhuǎn)基因線蟲株，正常情況下，daf-16 分布在胞質(zhì)，當(dāng)化合物作用于 Insulin-like 生長因子（IGF）信號通路時，daf-16 轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，在熒光顯微鏡下可見核內(nèi)聚集熒光，由此可以確定化合物是否對于該信號通路有作用。
e、線蟲長壽模型 II	該模型以 N2 線蟲株為實驗對象，通過固體培養(yǎng)方式，采用 FUDR 平板表面給藥的方式，以不作任何處理的 FUDR 平板作為對照，挑入 L4 后期 N2 株線蟲，20℃培養(yǎng)，統(tǒng)計兩種平板培養(yǎng)方法下 N2 株線蟲的壽命，能延長 N2 株線蟲壽命的化合物，可能具有抗衰老活性。
f、抗腦缺血藥藥效檢測	候選藥物配制成注射液，在大鼠再灌注后經(jīng)注射給藥。在給藥 24 小時和48 小時檢測大鼠行為，48 小時行為檢測后快速取腦切片染色并計算缺血面積。與模型組相比，如果注射了候選藥物的大鼠在行為評分或腦缺血面積上有所改善，則說明該候選藥物可能對中風(fēng)具有潛在的療效。這是目前篩選治療中風(fēng)藥物較為通用，也是較為可靠的方法。
g、抗老年癡呆藥藥效檢測	本模型用雙轉(zhuǎn)基因癡呆癥模型小鼠（PrP-hApp/hPS1 雙轉(zhuǎn)基因 AD 小鼠）進(jìn)行候選藥物活性檢測。該 AD 小鼠在 3 月齡出現(xiàn)認(rèn)知行為學(xué)變化，5 月齡出現(xiàn)老年斑，12 月齡有大量老年斑形成。通過觀察給藥后 AD 小鼠在 Morris 水迷宮實驗中的學(xué)習(xí)記憶能力，小鼠腦部 AChE 活性和 Aβ 含量來檢測和評價候選藥物抗老年癡呆能力，為候選藥物的進(jìn)一步臨床研究提供充分的實驗依據(jù)。
h、抗癲癇藥藥效檢測	本模型用生理鹽水作為空白對照組，乙琥胺、丙戊酸鈉及苯妥因鈉作為陽性藥對照組，采用給小鼠腹腔注射受試候選藥物，30 分鐘后皮下注射戊四氮，然后以“首次延遲 5 秒的 5 級癲癇發(fā)作時間、延遲 5 秒的 5 級癲癇發(fā)作次數(shù)及死亡情況”三個指標(biāo)初步評判受試化合物的抗癲癇藥效，為候選藥物的進(jìn)一步臨床研究提供充分的實驗依據(jù)。
i、抗抑郁藥藥效檢測模型	本模型用 C57BL/6J 小鼠作為研究對象，檢測候選藥物對小鼠在強(qiáng)迫游泳和懸尾情形下的行為反應(yīng)。使實驗小鼠在強(qiáng)迫游泳或懸尾的應(yīng)激狀態(tài)下持續(xù) 6分鐘，通過視頻軟件分析、比較后 4 分鐘的不動時間來評價候選藥物的抗抑郁能力，為候選藥物的進(jìn)一步臨床研究提供實驗依據(jù)。

3、心血管系統(tǒng)藥物活性篩選

體外血液學(xué)活性篩選模型

①活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血三項包括凝血酶原時間（PT）和凝血酶時間（TT）是化合物或候選藥物體外抗凝活性的重要檢測指標(biāo)。APTT主要用來檢測化合物或候選藥物對內(nèi)源性凝血的影響，PT主要檢測化合物或候選藥物對外源性凝血的影響，TT則是用來判斷化合物或候選藥物對共同凝血途徑的影響。該藥效學(xué)模型采用人質(zhì)控血漿試劑盒法進(jìn)行凝血三項測試，能夠篩選抗凝血活性化合物。

②血液凝固是一系列凝血因子相互激活形成酶促級聯(lián)反應(yīng)“凝血瀑布”的過程。血漿中有12種凝血因子，這些凝血因子是血液凝固的物質(zhì)基礎(chǔ)。純因子系統(tǒng)條件下，研究抗凝血化合物或候選藥物對這些凝血因子的活性影響，可以找出化合物或候選藥物的凝血作用機(jī)制和作用靶蛋白。本模型采用純?nèi)司壞蜃酉到y(tǒng)，酶學(xué)生色底物反應(yīng)法測定化合物對凝血因子的影響，以確認(rèn)化合物的抗凝血作用機(jī)制，目前主要包括：AT-III 依賴的抗凝血因子 IIa 和 Xa 活性；HCII 依賴的抗凝血因子 IIa 活性，抗凝血因子 Xase 酶活性，激活凝血因子 XII 活性。

4、治療糖尿病/代謝性疾病藥物活性篩選

a、胰島素增敏活性篩選模型

胰島素（Insulin）作用于肌肉和脂肪細(xì)胞后激活其信號通路，從而調(diào)動葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 4（GLUT4）從胞內(nèi)向胞膜轉(zhuǎn)運進(jìn)而完成葡萄糖攝取。不同的胰島素刺激濃度和 GLUT4 在胞膜上的表達(dá)量呈線性關(guān)系，故而檢測 GLUT4 的膜轉(zhuǎn)運率即為檢測胰島素敏感性的指標(biāo)。

該模型采用過表達(dá) GLUT4 的脂肪細(xì)胞作為檢測模型，量化化合物處理后GLUT4 在細(xì)胞膜上的分布量。利用 NIKON Ti-E 熒光顯微鏡和 Metamorph Offline

軟件實現(xiàn)對圖像的全自動采集和數(shù)據(jù)分析。根據(jù)化合物的作用時間不同，該模型可以分為急性或慢性檢測。此外，該模型具有靈敏性高、作用靶點明確等特點，是適合初步批量篩選胰島素增敏活性的有效模型。

b、葡萄糖重吸收抑制活性篩選模型

SGLT2全稱為2型鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運體,其生理功能是在腎臟近曲小管完成對原尿中約90%的葡萄糖重吸收。SGLT2抑制劑能夠抑制腎臟對葡萄糖的重吸收，通過增加尿糖排泄的方式降低機(jī)體血糖。同時，它不依賴于內(nèi)源性胰島素而發(fā)揮作用，降低血糖的同時能降低體重，是治療糖尿病藥物篩選中的一個新靶點。

該模型利用帶發(fā)光基團(tuán)的葡萄糖類似物 2-NBDG 作為指示劑（綠色發(fā)光），檢測永生化的人腎近曲小管上皮細(xì)胞 HK-2 細(xì)胞的葡萄糖攝取情況。因此，該模型對被測化合物抑制 SGLT2 的活性具有提示作用。適合靈敏、批量，快速地初步篩選有抑制活性的化合物。根據(jù)化合物作用時間的不同，該模型可以檢測化合物的急性或是慢性抑制活性。

c、減肥活性篩選模型

在正常情形下，脂肪細(xì)胞數(shù)目到了青春期后就不再增加。成年以后發(fā)胖的人，一般是脂肪細(xì)胞因儲藏過多脂肪而變大所造成。在人體內(nèi)，脂肪是以甘油三酯的形式儲存在脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴中。
油紅 O(Oil Red O)是一種易溶于甘油三酯的染料，可以通過 Oil Red O 染色方法來判斷脂肪細(xì)胞中脂肪的積聚水平。該模型采用分化成熟后的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞作為檢測模型，用 Oil Red O 染色法來檢測脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量，從而判斷化合物是否具有脂解作用，進(jìn)而篩選出有減肥活性的化合物。該方法靈敏、簡便、適合批量篩選。

d、抗胰島素抵抗活性篩選模型

胰島素抵抗（insulin resistance, IR）是胰島素發(fā)揮作用的靶器官組織（如脂肪和肌肉細(xì)胞）對一定劑量胰島素所產(chǎn)生的生理效應(yīng)低于正常水平的一種狀態(tài)，是2型糖尿病主要發(fā)病原因。該模型根據(jù) 2 型糖尿病中機(jī)體在維持較高胰島素濃度的條件下仍然不能有效發(fā)揮其生理效應(yīng)的特點，用高濃度胰島素孵育脂肪細(xì)胞，引起其產(chǎn)生胰島素抵抗。即在相同濃度的胰島素刺激下，與正常細(xì)胞相比，產(chǎn)生胰島素抵抗的細(xì)胞只能調(diào)動部分葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）上膜，不能有效完成葡萄糖攝取的功能。利用該模型可直接評價化合物抗胰島素抵抗的活性。根據(jù)化合物對細(xì)胞的作用時間不同，還可以分為急性或慢性檢測。該模型靈敏、靶點準(zhǔn)確，適合批量篩選。

5、皮膚化妝品活性篩選

a、B16、HDFa 細(xì)胞毒性實驗

通過 MTS 比色法，確定樣品的 CC50 (50% cytotoxicconcentration)，即對50%的細(xì)胞產(chǎn)生毒性時的藥物濃度，從而確定以下活性實驗的安全樣品濃度。細(xì)胞與樣品共同孵育后，加入 MTS 試劑，MTS 是一種新合成的四唑類化合物，能夠被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)，通過酶標(biāo)儀測定其490nm下的吸光值以確定細(xì)胞的存活率。與MTT 方法比較，MTS 比色法更加靈敏簡便，快速安全。

b、DPPH 自由基清除實驗

當(dāng)自由基超過人體的抗氧化防御能力時，受損的分子和細(xì)胞就會急劇增多，氧化損傷隨之產(chǎn)生，進(jìn)而可能導(dǎo)致炎癥、癌癥的發(fā)生，還會引起皮膚干燥、暗黃、松弛、產(chǎn)生皺紋等。因此篩選具有清除自由基活性的天然產(chǎn)物對于抗衰老化妝品的開發(fā)具有一定的意義。

本實驗利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）法來評價樣品的體外抗氧化能力。DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在515nm處有強(qiáng)吸收峰，當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH 會和清除劑提供的質(zhì)子結(jié)合形成 DPPH-H，從而使溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色，在 515nm 處的吸光度變小。以此來篩選具有體外抗氧化能力的天然產(chǎn)物。

c、酪氨酸酶活性抑制實驗

酪氨酸酶是黑色素生成過程中的主要限速酶，其活性與黑色素的合成量成正相關(guān)。研發(fā)能抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)將成為治療色素沉著性疾病的重要手段。
多巴在酪氨酸酶催化下轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟王?，多巴醌有兩種代謝途徑，第一種繼續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?，第二種與半胱氨酸相互作用后轉(zhuǎn)變?yōu)楹趾谒?。樣品如果能夠抑制酪氨酸酶的活性，即可間接抑制黑色素的生成，并且在 490nm 處的吸光值會變小，據(jù)此篩選具有抑制酪氨酸酶活性的樣品。

d、B16 細(xì)胞黑色素生成抑制實驗

黑色素是由黑素細(xì)胞合成分泌的，廣泛存在于人的皮膚、粘膜、視網(wǎng)膜、軟腦膜及膽囊與卵巢等處，黑色素分泌失調(diào)容易導(dǎo)致雀斑、黃褐斑、黑變病等疾病，因此篩選具有黑色素抑制活性的天然產(chǎn)物對于美白化妝品的研發(fā)具有重要意義。
本實驗所選細(xì)胞為小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16細(xì)胞），因為B16細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，特別是黑色素合成功能與人體正常的黑素細(xì)胞基本一致，因此B16細(xì)胞可作為比較理想的篩選模型。黑色素在 405nm 處有強(qiáng)吸收峰，當(dāng)樣品抑制 B16 細(xì)胞黑色素分泌時，吸光值會減小，以此計算黑色素生成抑制率。

e、促膠原蛋白分泌實驗

膠原蛋白是動物體內(nèi)最豐富的蛋白，占人體皮膚蛋白質(zhì)的 71.2%。皮膚中一旦缺乏膠原蛋白，膠原纖維就會發(fā)生交聯(lián)固化，細(xì)胞間黏多糖減少，皮膚失去彈性并變薄老化，因此篩選能夠促進(jìn)膠原蛋白分泌的天然產(chǎn)物對于抗衰老化妝品的研發(fā)具有一定的意義。
皮膚中主要以 I 型膠原蛋白為主，而 I 型膠原蛋白的分泌水平可以通過I型前膠原蛋白的分泌水平體現(xiàn)，所以本實驗通過檢測I型前膠原蛋白的方法來計算I型膠原蛋白的分泌增加率。