一、分離階段注意事項

1、組織塊培養(yǎng)法
1）組織塊接種后的前3天，從組織塊向外遷徙的細胞數(shù)很少，組織塊的黏附不牢固，在觀察和移動的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動和振動，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會脫落飄起。
2）加入的培養(yǎng)液不適合過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。
3）用組織塊培養(yǎng)時，要及時觀察，當(dāng)細胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細胞，因為已漂浮的組織塊和那些細胞碎片已經(jīng)死亡，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細胞的生長，要及時清除。
4）為促進組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。細胞培養(yǎng)過程中，膠原中的促細胞貼附因子先吸附于培養(yǎng)瓶底壁上，懸浮的圓形細胞再與已吸附有促貼物質(zhì)的底壁附著。

2、貼壁型原代細胞
1)原代培養(yǎng)的分離細胞在初次接觸體外環(huán)境時，雖然被分散成單個細胞，但它們之間的互相影響還是存在的，而且這種影響對細胞能否存活是非常重要的。在這些細胞之間能產(chǎn)生一些促生長的活性物質(zhì)，使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小，雖然營養(yǎng)物質(zhì)很充足，也很難使細胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進入獨立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細胞密度過大，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。
2）原代培養(yǎng)時初始培養(yǎng)在組織分散和分離細胞時細胞可能會受到嚴(yán)重的損傷。適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細胞密度，給培養(yǎng)的細胞提供更多的類似于在體內(nèi)時細胞之間的相互作用，會極大提高原代培養(yǎng)的細胞在體外存活率。待細胞適應(yīng)體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。
3）由于細胞之間的相互的內(nèi)在聯(lián)系被打破，分離細胞在體外培養(yǎng)時經(jīng)歷的生存環(huán)境改變很大，在體外存活和生長的難度相應(yīng)增加。對于貼壁依賴性細胞來說，盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，由于細胞懸液中帶有少量培養(yǎng)液，細胞即可以維持存活，又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁，是細胞迅速黏附于底物，待細胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3、懸浮型原代細胞
1）進行懸浮細胞培養(yǎng)時必須保持細胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為最低限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。
2）能夠進行懸浮培養(yǎng)的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。

二、分離后-傳代前注意事項

1、在原代培養(yǎng)的1天到2天內(nèi)，要特別注意觀察是否有細菌、真菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，防止造成其它細胞的交叉感染；
2、在細胞培養(yǎng)的過程中，要注意培養(yǎng)液顏色的變化，并根據(jù)培養(yǎng)液的顏色來決定換液時間。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色；當(dāng)培養(yǎng)液呈橙黃色時，細胞一般生長情況良好；呈淡黃色時，可能培養(yǎng)時間較長，營養(yǎng)不足，死亡細胞較多。所以，應(yīng)在培養(yǎng)液略黃時吸出部分舊培養(yǎng)液，然后補加同等數(shù)量的新鮮培養(yǎng)液。換液過程中，不要吸出細胞，不要使培養(yǎng)液溢出培養(yǎng)瓶，避免各種微生物的污染。換液時，應(yīng)將培養(yǎng)液事先預(yù)溫至37℃。
一般培養(yǎng)一天，組織細胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長。2天到3天后，細胞恢復(fù)增殖活動。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐漸增多，消耗的營養(yǎng)物越來越多，需要換液的時間越來越短。

三、傳代注意事項

1、離體培養(yǎng)的細胞生命力比較脆弱，因此傳代時細胞沒有生長到培養(yǎng)瓶底壁面積的80%以前，不要急于傳代。
2、首次傳代，由于原代培養(yǎng)中各種類型的細胞?；祀s生長，傳代時不同細胞又不同的消化時間，因而要根據(jù)需要注意及時處理。
3、對貼壁細胞消化后的吹打過程要有序進行，吹打時動作不宜過猛，否則會直接損傷細胞并產(chǎn)生能傷害細胞的氣泡。
4、首次傳代時適當(dāng)增大接種的細胞密度，使培養(yǎng)的細胞間盡快發(fā)生相互作用，有利于傳代細胞的存活。
5、傳代對細胞的影響或傷害程度僅次于將活細胞從生物體內(nèi)取出并進行原代培養(yǎng)的程度。只是因為傳代后的細胞生長并不像剛開始原代培養(yǎng)時那樣緩慢罷了。
6、盡可能減少傳代次數(shù)。每經(jīng)過一次傳代，細胞的生長環(huán)境就相應(yīng)發(fā)生一次較大變化。體外生長的細胞若處于動蕩的生活環(huán)境中，細胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)的細胞，往往容易轉(zhuǎn)化為惡性細胞