前言

生物分析能力是藥物臨床前研究和臨床研究的基石能力，是美迪西這類CRO機構(gòu)助力國內(nèi)外客戶順利推進藥物開發(fā)進程的技術(shù)基礎(chǔ)。生物分析雖然是一門技術(shù)性很強實踐性很強的工作領(lǐng)域，如果僅就分析看分析，僅就技術(shù)本身思考技術(shù)對于研發(fā)過程中遇到各種情況和問題的解決可能會帶來思路上的局限性。做好生物分析工作，離不開技術(shù)實踐，更離不開相關(guān)基礎(chǔ)理論知識的支撐，實踐反饋理論，理論指導(dǎo)實踐，一些基礎(chǔ)理論不僅具指導(dǎo)價值，有時也具啟發(fā)性，有利于廣拓視角。美迪西美研小編團隊推出生物分析系列專欄，邀請本領(lǐng)域的資深專業(yè)人員從不同的視角筆談生物分析相關(guān)的話題。

目前熱門和已上市的核酸藥物主要包括mRNA和寡核苷酸兩大類，mRNA既可以作為為疫苗，又可以作為治療性藥物，需要差異性地考慮其PK/PD的評估策略；寡核苷酸目前成藥的主要是ASO和siRNA，這些核酸藥物又兼顧了小分子與大分子藥物的一些PK/PD特征。

Part.1

基因治療與核酸類藥物

基因治療目前有多個不同層面的理解，狹義基因治療一般定義是使用正常的基因替代、糾正異常的基因，或者將異常的基因敲除以達到治療疾病的目的?；谥行姆▌t上去理解，狹義的基因治療也可以從另一個層面定義為通過糾正中心法則過程中出現(xiàn)的問題，如基因突變導(dǎo)致的功能性蛋白質(zhì)缺失或異常等（參見圖1和圖2），以達到治療疾病的目的。在廣義的基因治療概念下，溶瘤病毒、細胞治療，核酸類藥物均可被納入基因治療的范疇，但并不是所有的核酸藥物都屬于基因治療范疇，如mRNA藥物僅有一部分可以被納入基因治療的范疇。

圖1. 基因突變影響開放閱讀框而不能形成有功能的蛋白

圖2. 部分寡核苷酸藥物針對的遺傳病

目前的基因治療領(lǐng)域有兩個離不開核酸的有趣的現(xiàn)象，即RNA干擾和CRISPR基因編輯。RNA干擾和CRISPR基因編輯也都是一種生物體內(nèi)抗病毒感染的免疫機制，是在核酸水平上的免疫，有人稱其為基因免疫或基因組免疫。而經(jīng)典的免疫學(xué)里涉及的免疫系統(tǒng)中的免疫分子包括抗體、補體、配體、受體和細胞因子等成分一般都是氨基酸為基本組成單元的分子，沒有核苷酸作為基本組分的分子的直接參與。

未來是否有更多類似于RNA干擾和基因編輯的核酸層面的機制被發(fā)掘而可能會進一步地豐富我們對免疫學(xué)的認知，并且在基因組免疫領(lǐng)域的概念會越來越豐富、發(fā)展，甚至逐步成為免疫學(xué)的一大分支，或許也能作為我們的一種額外期待。

核酸藥物經(jīng)過幾十年的積累，在近幾年達到了爆發(fā)期。目前國內(nèi)外上市的基因治療藥物主要是mRNA疫苗和主要針對遺傳病的寡核苷酸類藥物（如圖3）。所以本文主要將核酸類藥物分為mRNA藥物和寡核苷酸藥物兩類，分別進行簡要闡述。

圖3. 國際上市的主要核酸類藥物（截至2023年3月，暫未列國內(nèi)廠家產(chǎn)品）

Part.2

mRNA類產(chǎn)品的PK/PD考察策略

mRNA藥物的優(yōu)勢包括：

（1）可以導(dǎo)入細胞，在體內(nèi)直接表達目的蛋白；

（2）mRNA的降解通過細胞正常代謝完成，無明顯的毒性；

（3）既能刺激體液免疫，又能刺激細胞免疫應(yīng)答；

（4）既可以開發(fā)為疫苗，又可以開發(fā)為治療性藥物等。

mRNA藥物的缺點包括：

（1）不穩(wěn)定，易被核酸酶等降解；

（2）制備工藝復(fù)雜；

（3）使用純生物藥的生產(chǎn)路徑；

（4）需要超低溫運輸?shù)取?/p>

制定mRNA產(chǎn)品臨床前藥代動力學(xué)藥效學(xué)（PK/PD）考察分析策略的前提是判斷其屬于疫苗還是治療性藥物。兩者存在以下不同：

（1）編碼蛋白的性質(zhì)不同，mRNA疫苗編碼病毒或腫瘤抗原蛋白，一般少量蛋白表達就可以發(fā)揮作用, 治療性藥物則通常需要更高的蛋白表達量；

（2）遞送要求不同，疫苗無需組織特異性，mRNA治療性藥物則期望遞送到特定的組織后進行翻譯表達；

（3）給藥方式不同，目前上市和在研mRNA疫苗多為肌肉注射，治療性藥物則根據(jù)具體治療性質(zhì)常采用系統(tǒng)給藥，甚至靶組織局部給藥；

（4）遵循的法規(guī)不同，mRNA疫苗需要遵循疫苗的指導(dǎo)原則，免疫原性屬于其PD指標，而治療性藥物則不同的遵循，免疫原性也非是研發(fā)者所期望。

mRNA疫苗可以在細胞內(nèi)表達病毒或細菌蛋白，刺激機體產(chǎn)生免疫保護性抗體，或者表達腫瘤新生抗原，從而制備個性化腫瘤疫苗。部分mRNA疫苗如針對基因突變產(chǎn)生的腫瘤新生抗原開發(fā)的疫苗，可以被認為是基因治療產(chǎn)品。但另一部分mRNA疫苗表達病毒抗原如新冠疫苗可直接表達SARS-CoV-2的刺突蛋白或刺突蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，一般不認為是基因治療產(chǎn)品，故如前所述只是部分mRNA產(chǎn)品屬于基因治療范疇。

mRNA疫苗臨床前PK/PD考察分析的要素主要有：

（1）預(yù)防用生物制品的指導(dǎo)原則中指出疫苗通常不需要進行常規(guī)的藥代動力學(xué)研究，但某些特殊類型疫苗應(yīng)需要進行生物分布的研究；

（2）非臨床研究中，需要研究mRNA和脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）或其它脂質(zhì)成分是否在接種疫苗的組織中分布，它們分布在哪些組織中，以及它們的持續(xù)時間。

（3）作為疫苗一般不用分析表達產(chǎn)物，但其表達產(chǎn)物的免疫原性相當于其重要的藥效指標。

基于mRNA疫苗的機制和效果，對于免疫原性方面，既要考慮結(jié)合抗體又要考慮中和抗體，不僅考慮B細胞免疫還要考慮細胞免疫（參見圖4），與治療性藥物相比，mRNA疫苗的免疫原性很強，一般不需要使用高成本高靈敏的檢測技術(shù)進行結(jié)合抗體的檢測。

圖4. mRNA疫苗作用機制示意圖

mRNA治療性藥物有如下效用方式：

（1）抗體效用，即直接表達用于治療當前和新發(fā)疾病的預(yù)防性或治療性抗體；

（2）蛋白替代療法，即直接表達一種人類蛋白來解決遺傳疾病，如血友??；

（3）基因編輯/堿基編輯，即表達基因組編輯蛋白或堿基編輯蛋白來修飾人類基因表達。

mRNA治療性藥物通過編碼功能性治療蛋白，由所表達的蛋白產(chǎn)物發(fā)揮治療作用。該類藥物的臨床前PK/PD分析需要有以下兩個考慮點：

（1）PD的持續(xù)與mRNA產(chǎn)物的表達量和表達時相相關(guān)，即存在一定的量效關(guān)系；

（2）藥物的PK研究如吸收和分布的研究有利于評價量效關(guān)系。

mRNA治療性藥物的臨床前PK/PD分析需要考查的要素有：

（1）PK分析：即mRNA濃度隨時間變化的分析；

（2）將表達產(chǎn)物，即目標蛋白的表達量與分布作為PD指標進行分析；

（3）脂質(zhì)體成分的藥代分布分析，尤其是新型脂質(zhì)輔料。

此外，PK/PD與免疫原性間通常具有關(guān)聯(lián)性，對于mRNA治療性藥物需要同時分析mRNA本身和脂質(zhì)體成分的免疫原性影響，聚乙二醇化LNP產(chǎn)生抗體已有報道，抗PEG抗體已被廣泛研究和報道，筆者所在機構(gòu)也分析出LNP的PEG成分可見一定程度的免疫原性，筆者所在機構(gòu)表達IgG1亞型抗體的治療性mRNA產(chǎn)品在食蟹猴靜脈給藥的PK/PD試驗例中全面兼顧了本文所列要點。

圖5. mRNA治療性藥物的PK/PD研究設(shè)計實施例

Part.3

寡核苷酸類產(chǎn)品的PK/PD考量

目前寡核苷酸類產(chǎn)品成藥上市的主要為反義寡核苷酸（ASO）與siRNA，而miRNA研發(fā)進入臨床試驗的極少，所以本部分的分析僅以ASO與siRNA藥物為代表。ASO和siRNA的主要區(qū)別在于，前者是單鏈，后者是雙鏈RNA。而雙鏈的siRNA作用機制與RISC形成有關(guān)，RISC可反復(fù)作用靶標mRNA； siRNA被釋放的正義鏈或被降解，也可作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶的催化下以靶mRNA為模板擴增得到dsRNA，dsRNA又可被Dicer降解成siRNA，進入RNAi循環(huán)，所以藥物效果更持久甚至有級聯(lián)放大效果。

寡核苷酸類藥物的PK特征包括：

（1）靜脈給藥和其它途徑給藥，藥物進入靶部位的方式不同，導(dǎo)致體內(nèi)的PK過程也不一樣；

（2）裸siRNA不穩(wěn)定，易被血液和組織中核酸酶降解；

（3）容易在肝臟和腎臟中聚集，并經(jīng)腎臟排泄；

（4）非腦內(nèi)給藥時，不易過腦；

（5）兩條鏈被修飾的方式不一樣，導(dǎo)致兩條鏈的PK參數(shù)比如峰濃度和暴露量不一致；

（6）在給藥局部存留時間長；

（7）血液清除速度要快于組織；

（8）目前的藥物基本都為體外合成的RNA分子，可被免疫系統(tǒng)吞噬，有些還會激活天然免疫，如toll樣受體參與引發(fā)免疫反應(yīng)，比如干擾素（IFN-α、IFN-β)、細胞因子（TNF-α、IL-6）產(chǎn)生等。寡核苷酸藥物主要經(jīng)核酸內(nèi)或外切酶代謝為短核苷酸碎片，和蛋白類藥物被蛋白酶切割降解為氨基酸類似，所以寡核苷酸藥物與傳統(tǒng)大分子藥物的代謝上有雷同之處，但許多寡核苷酸現(xiàn)實又多見修飾，其代謝產(chǎn)物分析仍需周全考慮；另其分子量是遠大于小分子和一些多肽，分子量較大，需要考慮免疫原性潛在的對其PK/PD特征的影響。

寡核苷酸類藥物PK/PD考察分析的策略要點主要包括：

（1）按照小分子藥物PK研究思路設(shè)計相關(guān)研究內(nèi)容；

（2）兼顧其大分子藥物的部分特征，考慮免疫原性的影響，如抗藥物抗體（ADA）的分析，考慮代謝清除緩慢的特點；

（3）對于siRNA，分析反義鏈和有義鏈所表征的PK行為是否有差異；

（4）必要時，注意考察制劑輔料的PK特點；

（5）設(shè)置相應(yīng)PD指標，如新功能蛋白的水平變化;

（6）適當設(shè)置細胞因子、補體等PD生物標志物指標，針對輔料如PEG的抗體檢測;

（7）利用合適平臺技術(shù)開發(fā)滿足實際靈敏度需求且穩(wěn)定的PK生物分析方法是一大挑戰(zhàn)。

分析寡核苷酸類藥物的PK/PD，離不開對其免疫原性的察。因為寡核苷酸類藥物是外源性核酸分子，分子量偏大，并且是潛在的弱抗原或半抗原。而免疫原性產(chǎn)生的主要原因可能與其產(chǎn)品因素、產(chǎn)品的藥理學(xué)因素以及給藥對象因素有關(guān)，藥理學(xué)因素以及給藥對象因素具體機制與其它大分子的這兩方面因素大致相同，重點要考慮該類產(chǎn)品潛在引起免疫原性的本身的產(chǎn)品因素的不同如鏈型、堿基序列、堿基修飾、遞送載體成分、骨架修飾等。免疫原性的考察點的考慮基于siRNA等寡核苷酸的外源性性質(zhì)，宿主系統(tǒng)會將其視為病原體，免疫系統(tǒng)可以通過細胞外和細胞內(nèi)不同的病原相關(guān)分子模式（PAMP）受體識別單鏈和雙鏈RNA與toll樣受體（TLRs）相互作用產(chǎn)生免疫應(yīng)答；以及TLRs刺激炎癥細胞因子和I型干擾素（IFN）的過量產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。既要考慮體液免疫分析，又要考慮除寡核苷酸本身外的載體成分，甚至藥效機制發(fā)揮而生成的新的功能性蛋白成分的免疫原性。

Part.4

分析策略與技術(shù)應(yīng)用

核酸類藥物尤其是寡核苷酸類藥物，對生物分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)。寡核苷酸類藥物的分子量不大不小、并存在藥物不穩(wěn)定、鏈型、修飾、弱免疫原或半抗原（導(dǎo)致特異陽性抗體的制備存在現(xiàn)實困難）等特征，這些都是構(gòu)成其分析挑戰(zhàn)的幾大因素。

目前主要有5種主流技術(shù)可以進行核酸類藥物的PK分析，包括PCR技術(shù)、H-LBA、b-DNA、基于雜交的LC-UV/PL以及LC-MS/MS和LC-HRMS（圖6）。

其中，qPCR技術(shù)可以方便地檢測長度較長的核酸類藥物，靈敏度高，檢測范圍寬，但是需要復(fù)雜的樣品處理過程；ddPCR靈敏度更高，但耗材費用高，成本高；對于較短的核酸檢測來說，雖然也可以通過莖環(huán)qPCR（Stem-Loop qPCR）的設(shè)計實現(xiàn)，實施相對于較大的核酸要復(fù)雜。H-LBA方法的特異性高，靈敏度好，但是檢測效果非常依賴于探針的可靠性和設(shè)計技巧及反應(yīng)過程細節(jié)的優(yōu)化；b-DNA方法其實是H-LBA技術(shù)的拓展版，有很高的特異性、準確性和更高的靈敏度，但檢測效果同樣高度依賴于特殊的探針設(shè)計及雜交反應(yīng)技術(shù)細節(jié)；基于雜交的LC-UV/FL方法可以測定較長核酸類藥物，具備較好的特異性和準確性，但是樣品處理復(fù)雜，靈敏度對熒光探針的準確性高度依賴；LC-MS/MS和LC-HRMS方法也可以用于核酸類藥物的分析，選擇性好，可以區(qū)分全長和代謝產(chǎn)物，但是對非修飾的寡核苷酸類藥物檢測靈敏度和特異性相對較差，并且價格昂貴，不適宜測過長的核酸分子。其它的活體熒光成像，同位素示蹤、原位雜交、熒光原位雜交等分析技術(shù)可以作為補充手段，應(yīng)用于不同的目的和研究階段，但它們的精準度差，不大適合作為后續(xù)的驗證用方法。

圖6. 核酸類藥物生物分析的主流技術(shù)對比

總結(jié)

近年來，核酸類藥物是近幾年來最熱門一大新藥研究方向。但核酸類藥物尤其是寡核苷酸類藥物與傳統(tǒng)小分子與大分子藥物成分存在顯著區(qū)別，給核酸類藥物的生物分析和PK/PD考察帶來了較大的技術(shù)挑戰(zhàn)。mRNA藥物作為疫苗和治療性藥物時考慮點不同，寡核苷酸類藥物同時兼顧了大小分子的一些PK/PD特征，需要根據(jù)具體的分子特征選擇PK/PD考察評估策略和分析的技術(shù)應(yīng)用策略。

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