美研| CMC系列(九) 定量核磁那些事兒：定量核磁應(yīng)用及其方法驗(yàn)證

2023-12-18

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開篇引言

核磁共振是基于特定原子核（主要為I=1/2的¹H、¹³C、¹⁵N、¹⁹F、³¹P等）在外磁場（1~21 Tesla，1 tesla=10⁴guass）中吸收了與其分裂能級間能量差相對應(yīng)的射頻場能量而產(chǎn)生共振的原理。核磁共振兼具定性分析及定量檢測兩種優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、食品、藥品等領(lǐng)域。

01 定量核磁原理與應(yīng)用

定量核磁技術(shù)（Quantitative Nuclear Magnetic，簡稱QNMR)主要是基于1H-NMR，待測化合物1H-NMR譜上各信號峰強(qiáng)度之比等于相應(yīng)的質(zhì)子數(shù)之比，確定氫的積分值與其摩爾濃度成正比，定量核磁方法分為相對定量法和絕對定量法。相對定量法是QNMR中最簡單的，通過比較2種或2種以上成分特征峰的峰面積來確定含量；絕對定量法是以結(jié)構(gòu)和含量已知的化合物為參照，與待測物制成溶液進(jìn)行測定，通過比較兩者的信號積分強(qiáng)度來確定待測物的含量，絕對定量法根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法不同又分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法。

定量核磁技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有以下方面：

▲反應(yīng)過程監(jiān)測
▲對照品賦值
▲原料藥含量測定
▲藥物制劑的含量測定
▲藥物的雜質(zhì)檢查
▲化合物純度檢查
▲多組分純度確定
▲代謝組學(xué)研究
▲聚合物組成研究等。

定量核磁原理與應(yīng)用.jpg

02 藥典法規(guī)要求

2010版中國藥典二部附錄中首次提到核磁共振波譜法，2020版改為四部通則0441核磁共振波譜法。USP現(xiàn)行版、EP 10.8版、JP第18版和中國藥典2020年版的NMR法通則內(nèi)容對比如下表所示。中國藥典2020年版0441通則包括原理、NMR儀、核磁共振譜、測定方法四部分。定量分析中提供了絕對定量模式和相對定量模式的供試品溶液制備方法、測定方法和計(jì)算公式，并簡要例舉了需要注意的實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置及優(yōu)化項(xiàng)目。

內(nèi)容

USP現(xiàn)行版<761>、<1761>

EP 10.8版2.2.33

JP 18版2.21

中國藥典2020版0441

引言

簡介、原理、適用范圍

簡介、原理

核磁儀器確認(rèn)

DQ、IQ、PQ，系統(tǒng)適用性測試、確證測試

定義

共振、信號、波譜、模式、峰、線、躍遷

設(shè)備

磁體、探頭(樣品旋轉(zhuǎn)、核磁共振管 )、控制臺和計(jì)算機(jī)，儀器準(zhǔn)備(磁體與場、探頭調(diào)諧和匹配)

儀器組成(磁體、探頭、控制臺和計(jì)算機(jī))、證明儀器正確工作的測試方法

FT-NMR波譜儀、連續(xù)波核磁共振(CW-NMR)波譜儀類型

儀器組成、儀器輸出譜圖的過程

測定方法

溶劑選擇、樣品處理

測定程序、樣品處理

氫譜和碳譜的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

溶劑選擇、樣品處理、樣品檢測

定性和定量分析

定性應(yīng)用、定量應(yīng)用(相對定量、絕對定量、外部校準(zhǔn)、進(jìn)一步的校準(zhǔn)注意事項(xiàng)、一般程序、計(jì)量溯源性和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇、樣品制備、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)分析 )

定性分析、定量分析(內(nèi)標(biāo)法、規(guī)范化過程 )

定性和定量分析
?定性分析
?定量分析(絕對定量模式、相對定量模式)

采集參數(shù)

光譜寬度、停留時(shí)間、數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)、采集時(shí)間、掃描次數(shù)、射頻、接收器增益和脈沖寬度，后脈沖延遲，重復(fù)延遲

參數(shù)(脈沖寬度、死時(shí)間、采集時(shí)間、重復(fù)時(shí)間、接受增益 )

記錄儀器和測定條件

采集后數(shù)據(jù)處理

增加信噪比或光譜分辨率、零填充、傅里葉變換定相、基線校正、采峰、積分、高級處理解

為定量目的優(yōu)化采集和處理參數(shù)(數(shù)字分辨率、信噪比、整合區(qū)域、動態(tài)范圍 )

NMR分析方法的驗(yàn)證和確認(rèn)

生命周期方法的分析方法驗(yàn)證
?ATP
?第一階段一方法設(shè)計(jì) (分析方法開發(fā)、QRMMODR、復(fù)制策略、分析控制策略 )
?第二階段一APPQ(APPQ程序、測量不確定度APPQ結(jié)果和文檔)
?第三階段一CPPV (日常監(jiān)測、分析方法的變更)傳統(tǒng)分析方法驗(yàn)證(準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、工作范圍、定量限、耐用性、溶液穩(wěn)定性 )、分析方法確認(rèn)

溶液核磁共振應(yīng)用

結(jié)構(gòu)解析和表征(示例 )、鑒別(示例)、定量(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品制備、1D qNMR、2D qNMR )

使用化學(xué)位移、譜峰多重性和相對強(qiáng)度進(jìn)行鑒別，使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒別

SSNMR

MAS、高功率去耦和CP三種技術(shù)和應(yīng)用

臺式核磁共振儀

臺式時(shí)域NMR儀、臺式頻域NMR儀、臺式核磁共振應(yīng)用

03 定量核磁方法開發(fā)思路

氘代試劑

▲ 待測物及內(nèi)標(biāo)物在所選氣代試劑中完全溶解;

▲ 關(guān)注待測物性質(zhì)，不與氣代試劑發(fā)生反應(yīng);

▲ 必要時(shí)可加入重水或TFA移除水峰干擾。

內(nèi)標(biāo)物的選擇

▲ 內(nèi)標(biāo)物的選擇由待測物出峰情況確定;

▲ 內(nèi)標(biāo)物定量峰與待測物出峰不重疊;

▲ 關(guān)注內(nèi)標(biāo)物化學(xué)性質(zhì)，不與待測物反應(yīng)

▲ 內(nèi)標(biāo)物樣品性質(zhì)穩(wěn)定，定量峰峰型簡單

定量峰的選擇

▲ 定量峰與其他信號峰基線分離;

▲ 定量峰之間靠近，峰型接近，避免基線帶來的干擾;

▲ 不選活潑區(qū)信號峰作為定量峰;

▲ 盡量避免衛(wèi)星峰的干擾。

樣品的前處理

▲ 為減少稱量誤差使用精密度高的分析天平稱量，同時(shí)稱量量在10mg以上;

▲ 如果樣品活潑氫較多，可以滴加重水、氘代甲醇等試劑去除活潑氫;

▲ 樣品完全溶解是必要的。

采集參數(shù)設(shè)置

▲ 掃描次數(shù):保證定量峰的信噪比足夠;

▲ 弛豫延遲:保證重復(fù)掃描時(shí)信號能夠完全弛豫，一般為5倍以上的T1;三角形;

▲ 脈沖激發(fā):O1P應(yīng)在待測物和內(nèi)標(biāo)物信號頻率之間，減少偏共振效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

▲ 手動積分一般較自動積分準(zhǔn)確;

▲ 避免衛(wèi)星峰以及基線下雜峰的干擾;

▲ 必要時(shí)對基線、峰相位進(jìn)行矯正，使峰型對稱，減少積分誤差;

▲ 內(nèi)標(biāo)物和待測物的定量峰積分應(yīng)較為接近。

誤差分析

▲ 待測物和內(nèi)標(biāo)物定量峰響應(yīng)差距過大;

▲ 稱量誤差，最好保證樣品稱量值大于天平最小稱量值的兩倍以上;

▲ 儀器參數(shù)的影響，如共振偏移、AQ設(shè)置不當(dāng)RG值設(shè)置過小等造成的影響。

交付驗(yàn)收

▲ 開具相關(guān)驗(yàn)收報(bào)告;

▲ 如有需要樣品可以回收處理。

04 美迪西的設(shè)備技術(shù)和服務(wù)

美迪西核磁分析平臺擁有強(qiáng)大成熟的分析設(shè)備、完整合規(guī)的樣品檢測分析流程、從目標(biāo)化合物的制備到鑒定（結(jié)構(gòu)確認(rèn)）再到定量賦值（雜質(zhì)COA）的一條龍服務(wù)。研究結(jié)果滿足藥物注冊申報(bào)研究要求，同時(shí)積極配合客戶完成審計(jì)及藥監(jiān)部門的現(xiàn)場核查工作。

美迪西的設(shè)備技術(shù)和服務(wù).jpg

05 案例分享

上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司研究團(tuán)隊(duì)累積了豐富的藥物定量核磁研究，接下來隨小編從以下兩個(gè)案例，與大家共同探討藥物定量核磁方法學(xué)的研究。

案例一：API光照降解雜質(zhì)對照品
制備后鑒定及QNMR賦值

項(xiàng)目背景

▲ API中的光照降解未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定及賦值；
▲ 目標(biāo)雜質(zhì)API中僅少量存在，需要進(jìn)行干預(yù)破壞；
▲ 目標(biāo)雜質(zhì)制備后容易降解，考察其保存穩(wěn)定條件；
▲ 制備出穩(wěn)定狀態(tài)雜質(zhì)后進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及QNMR進(jìn)行賦值；
▲ 交付結(jié)構(gòu)鑒定報(bào)告及目標(biāo)雜質(zhì)標(biāo)化COA。

目標(biāo)雜質(zhì)核磁圖譜數(shù)據(jù).jpg