開篇引言

世界著名作家、大思想家斯賓塞·約翰遜曾經(jīng)說過“唯一不變的是變化本身”，而在藥物研發(fā)過程中，藥物活性成分的合成往往伴隨著雜質(zhì)的生成，任何物質(zhì)的純凈程度只能無限接近100%，在人類認知的范圍內(nèi)目前還不存在100%純凈的物質(zhì)，換句話說“認知中可以存在的純凈物質(zhì)那只有不純物了”。

1 藥物雜質(zhì)與基因毒性雜質(zhì)介紹

關(guān)于雜質(zhì)，異于活性成分的物質(zhì)我們將其統(tǒng)稱為雜質(zhì)，這些成分通常是無效的、與活性成分使用目的無關(guān)或者是有其他毒副作用的物質(zhì)。而藥物的質(zhì)量研究過程就是通過目前人類所掌握的分析手段，對異于活性成分的物質(zhì)進行定性和定量研究，并基于ICH、藥典等相關(guān)指導(dǎo)原則并結(jié)合文獻數(shù)據(jù)等手段對這些雜質(zhì)進行安全限度的制定和評估，藥物研發(fā)中的雜質(zhì)可分為有機雜質(zhì)（與工藝和藥物結(jié)構(gòu)有關(guān)的）、無機雜質(zhì)和殘留溶劑等。

雜質(zhì)的存在通常會帶來潛在的安全性風(fēng)險，對患者來說有害而無益，其中高毒高活性雜質(zhì)、基因毒性（致突變、致癌性等）雜質(zhì)更是藥物研發(fā)過程中的控制重點，其研究思路通常為雜質(zhì)的定性、雜質(zhì)的制備、結(jié)構(gòu)確證與表征、限度制定、控制方式制定、高靈敏度的分析方法開發(fā)與驗證等。

對于藥物的研制原則，通常遵循ICH相關(guān)指導(dǎo)文件的研究思路，即人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會議（The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; ICH）。

ICH是由歐盟、美國、日本三方成員國于1990年共同發(fā)起，對三方成員國家的人用藥品注冊技術(shù)要求的現(xiàn)存差異進行協(xié)調(diào)的國際組織。1994年3月15日，ICH Q3由指導(dǎo)委員會同意進入第二階段，公開意見征求，藥物研發(fā)過程中的雜質(zhì)研究進入到了人們的系統(tǒng)關(guān)注中，從1995年3月30日開始，ICH相繼發(fā)布Q3A（新原料藥中的雜質(zhì)）、Q3B（新制劑中的雜質(zhì)）、Q3C（雜質(zhì)：殘留溶劑指南）、Q3D（元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則），建立了ICH成員國和遵循ICH原則國家的統(tǒng)一雜質(zhì)研究標準，具體的提出了雜質(zhì)控制策略和限度要求等內(nèi)容^[1]。

隨著科技的進步和分析手段的完善以及人們對學(xué)科的認識和對化合物的深入研究，發(fā)現(xiàn)某些雜質(zhì)在極低的濃度下即可誘導(dǎo)基因突變并導(dǎo)致染色體的斷裂和重排，具有潛在的致癌性，這類雜質(zhì)人們將其定義為致突變雜質(zhì)。Q3A和Q3B僅能為大多數(shù)雜質(zhì)的定性和控制提供指導(dǎo)，對DNA反應(yīng)性雜質(zhì)的指導(dǎo)很有限，2013年2月6日，ICH M7（基因毒性雜質(zhì)）獲得執(zhí)行委員會批準，并且發(fā)布供公眾參考，為醫(yī)藥研發(fā)生產(chǎn)提供了一個用于致突變雜質(zhì)的鑒別、分類、定性和控制的可行性框架方案，用于控制雜質(zhì)潛在的致癌性風(fēng)險。至此，ICH針對藥物中雜質(zhì)研究的框架已基本搭建完成。

根據(jù)致突變潛力和致癌性對雜質(zhì)進行分類，通常以數(shù)據(jù)庫和文獻的檢索獲得的雜質(zhì)致癌性和細菌致突變數(shù)據(jù)對實際和潛在雜質(zhì)進行初步分析，危害性評估將其歸類為1類、2類或5類。若無法獲得這些數(shù)據(jù)，則應(yīng)進行預(yù)測細菌致突變性的構(gòu)-效關(guān)系（SAR）評估。根據(jù)評估結(jié)果將其分為3類、4類或5類^[2]。

上表中多次提到了警示結(jié)構(gòu)，警示結(jié)構(gòu)是化合物結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系的研究總結(jié)的一系列結(jié)構(gòu)，主要是結(jié)構(gòu)與毒理學(xué)毒性的關(guān)系，需要注意的一點是，有警示結(jié)構(gòu)的化合物不一定具有遺傳毒性，有遺傳毒性的化合物通常具有警示結(jié)構(gòu)。

目前，一般將致癌物分成兩大類：

一類是遺傳毒性致癌物（geno-toxic carcinogens），通過化學(xué)鍵合直接破壞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生致癌性，大多數(shù)的化學(xué)致癌物具有遺傳毒性；

第二類是非遺傳毒性致癌物（epicarcinogens，或稱為外遺傳性致癌物），通常不與DNA發(fā)生化學(xué)鍵合作用，不對DNA產(chǎn)生直接破壞，而是通過遺傳物質(zhì)外的間接機制引起致癌作用（如促進細胞過度增殖等），這類致癌物在致突變試驗（如Ames試驗）中一般呈陰性結(jié)果。

盡管非遺傳毒性致癌物的致癌作用機制各不相同，但遺傳毒性致癌物的作用機制卻表現(xiàn)出較高的一致性，這類物質(zhì)具有DNA反應(yīng)活性，通過與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)鍵合引起遺傳信息的改變并產(chǎn)生致癌性，基因突變往往是此類物質(zhì)產(chǎn)生致癌性的起始步驟。遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)通常是指雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些特殊基團或結(jié)構(gòu)分子。這些特殊的結(jié)構(gòu)單元具有與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的能力傾向，一旦遺傳物質(zhì)發(fā)生改變則通常會誘導(dǎo)基因突變或者導(dǎo)致染色體重排或斷裂，因此具有潛在的致癌/致突變風(fēng)險。Ashby等總結(jié)提出了18種警示結(jié)構(gòu)的模型，根據(jù)這18中警示結(jié)構(gòu)整合成的“超級致癌物”虛擬化合物分子。

超級致癌物的虛擬結(jié)構(gòu)

致突變雜質(zhì)的安全閾值較一般雜質(zhì)低很多，很低含量的情況下便可可能會引發(fā)致突變或致癌，因此對其控制要求更加嚴格，對工藝要求和對分析檢測能力的要求也非常高。警示結(jié)構(gòu)對于雜質(zhì)的遺傳毒性和致癌性具有提示作用，對于警示結(jié)構(gòu)的早期識別和規(guī)避有助于提高藥物研發(fā)的效率、降低生產(chǎn)和控制成本。正如上文所說，致癌性雜質(zhì)可分為遺傳毒性和非遺傳毒性，在結(jié)構(gòu)上可分為遺傳毒性致癌性警示結(jié)構(gòu)和非遺傳毒性致癌性警示結(jié)構(gòu)^[3]，如下表：

就像上文中所提到的，含有警示結(jié)構(gòu)的化合物不一定具有遺傳毒性，而有遺傳毒性的化合物也不一定會產(chǎn)生致癌性。遺傳毒性雜質(zhì)的限度計算通常包含TD₅₀、TTC法等，篇幅有限這里不做更多的說明。

化合物是否具有遺傳毒性，單單從是否含有警示結(jié)構(gòu)上判斷是不夠科學(xué)也不夠嚴謹?shù)模€需結(jié)合化合物相關(guān)毒理學(xué)文獻檢索，雜質(zhì)化合物軟件評估預(yù)測以及Ames試驗等進行判斷，基于大量理論研究和實踐經(jīng)驗總結(jié)出的警示結(jié)構(gòu)，對于雜質(zhì)的潛在致癌性有一定提示作用。因此在進行雜質(zhì)安全性評估和控制策略選擇時，對于缺少遺傳毒性數(shù)據(jù)的雜質(zhì)，警示結(jié)構(gòu)作為區(qū)分普通雜質(zhì)和“高活性”雜質(zhì)的標志可以提高篩選效率、減少毒理學(xué)評價的工作量。但是應(yīng)當指出，警示結(jié)構(gòu)的存在與否并不能明確給出該雜質(zhì)是否具有遺傳毒性和致癌性的結(jié)論。對于缺少遺傳毒性數(shù)據(jù)的雜質(zhì)，警示結(jié)構(gòu)可以作為辨識遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)的起點，之后才會考慮啟動構(gòu)-效關(guān)系預(yù)測和體內(nèi)外安全性研究，以進一步確認該雜質(zhì)是否具有遺傳毒性和致癌性。

2 美迪西設(shè)備技術(shù)和服務(wù)

美迪西是一家專業(yè)的生物醫(yī)藥臨床前綜合研發(fā)服務(wù) CRO，其中藥學(xué)研究板塊CMC包括原料藥研究、質(zhì)量標準建立、穩(wěn)定性研究和申報服務(wù)。在致突變雜質(zhì)研究的方向，美迪西具有專業(yè)的雜質(zhì)評估團隊，可支持毒性試驗研究、Ames試驗，同時引入了專業(yè)結(jié)構(gòu)評估軟件 Case Ultra，軟件同時包含基于統(tǒng)計學(xué)的和基于專家規(guī)則的模型，兩個模型組合可以完整的滿足ICHM7 要求。對于致突變雜質(zhì)的研究，美迪西有專業(yè)經(jīng)驗豐富的雜質(zhì)定性定量研究團隊和國內(nèi)先進的儀器設(shè)備,儀器包括 Bruker 400M HMR、Agilent 5977A GC-MS、Agilent 7000D GC-MSMS、Agilent/SHIMADZU/Thermo Fisher LC-MS、Agilent 6470 LC-MSMS、Thermo Fisher Q Exactive Plus HRMS 等。

3 美迪西案例分享

某原料藥在合成制備工藝中，根據(jù)評估分析可能因試劑和工藝過程引入苯、烯丙基溴、烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷，根據(jù)ICH Q3C殘留溶劑部分，苯歸屬于1類溶劑，屬高毒高活性雜質(zhì)，期限度為2ppm；烯丙基溴、烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷，根據(jù)結(jié)構(gòu)判斷其屬于鹵代烷烴類化合物，含有鹵代烷烴警示結(jié)構(gòu)，使用Case Ultra基于統(tǒng)計學(xué)的和基于專家規(guī)則的模型評估，軟件模擬結(jié)果烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷雜質(zhì)分類為1類，烯丙基溴雜質(zhì)分類為2類。

查閱相關(guān)文獻并結(jié)合原料藥的最大使用劑量，從嚴控制雜質(zhì)限度，最終確定苯的限度2ppm、烯丙基溴38ppm、烯丙基氯35ppm、1-溴-3-氯丙烷30ppm。

采用GC-MS定量檢測，在Scan模式下確定各組分化合物的定性離子和定量離子。70eV條件，Scan模式下總離子流質(zhì)譜信息如下：

在排除各組分化合物互相干擾的離子情況下，確定各組分的定性和定量離子，苯的定性離子m/z 51和m/z 77，定量離子m/z 78；烯丙基溴m/z 81和m/z 122，定量離子m/z 120；烯丙基氯m/z 75和m/z 78，定量離子m/z 76；1-溴-3-氯丙烷m/z 79和m/z 156，定量離子m/z 158。

定量模式SIM模式下，各組分化合物滿足ppb級別極低的靈敏度要求。

[1] ICH Q3A(R2) 新原料藥中的雜質(zhì)

[2] ICH M7(R2) 遺傳毒性雜質(zhì)

[3] 馬磊,馬玉楠,陳震等.遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)[j].中國新藥雜志,2014,23(18):2106 2111)

CMC系列(一)淺談藥物研發(fā)中原料藥工藝研究的重要性

CMC系列(二)藥學(xué)研究之世界銀屑病日

CMC系列(三)高端吸入藥物的市場格局和研究現(xiàn)狀

CMC系列(四)淺談手性藥物的研究策略

CMC系列(五)藥物晶型控制策略

CMC系列(六)含氮類化合物-可揮發(fā)堿性有機胺的氣相分析

CMC系列(七)新藥研究中的固態(tài)開發(fā)挑戰(zhàn)及應(yīng)對策略

CMC系列(八)淺析ICH指導(dǎo)原則Q3C及未收錄殘留溶劑限度制定方法

CMC系列(九)定量核磁應(yīng)用及其方法驗證/定量核磁那些事兒