HILIC模式簡(jiǎn)單介紹

HILIC是一種色譜分離技術(shù)-親水作用色譜（hydrophilic-interaction chromatography）的簡(jiǎn)稱，也稱為非水反相色譜或者反反相色譜，由Alpert教授于1990年提出，并將HILIC模式和正相模式（NPLC）進(jìn)行了區(qū)分^[1]。

HILIC模式和正相有著類似的洗脫方式，由于使用了反相溶劑系統(tǒng)（水和有機(jī)相），從而具備正相所沒有的優(yōu)勢(shì)，例如系統(tǒng)中可以含水，對(duì)于化合物的稀釋劑選擇更多，重現(xiàn)性更好，可以連接MS進(jìn)行聯(lián)用等等（HILIC模式含有高比例有機(jī)相，相比于水相更多的反相，更容易去溶劑化，增加離子化效率，提高靈敏度，如圖1所示）。HILIC模式可以避免使用離子對(duì)試劑，對(duì)于大極性化合物的制備很有益。HILIC模式廣泛應(yīng)用于大極性化合物的分離，例如藥物、糖類、蛋白、多肽、氨基酸等等。

圖1：不同模式對(duì)化合物的應(yīng)用范圍

HILIC模式作用機(jī)理

HILIC的保留機(jī)制是液液分配、吸附作用、離子相互作用和親水性保留作用等多種模式作用的綜合體現(xiàn)，化合物的保留一般受其化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)、固定相和流動(dòng)相作用以及流動(dòng)相種類（有機(jī)溶劑種類以及流動(dòng)相pH）影響。

HILIC模式的色譜柱的固定相采用未衍生化硅膠或雜化顆粒、酰胺基、氨基、二醇、兩性離子、環(huán)糊精類、聚琥珀酰亞胺鍵合物質(zhì)等極性填料，所以化合物的保留強(qiáng)度和其極性成正比，和流動(dòng)相極性成反比。極性溶劑的存在可以使固定相表面形成一層極性層，如圖2所示，因此對(duì)于利用液液分配作用進(jìn)行保留的化合物，流動(dòng)相中極性溶劑是必不可少的，一般至少包含3%極性溶劑 ^[2]。

圖2：胞嘧啶在流動(dòng)相和固定相表面吸附水層液液分配

在流動(dòng)相中添加緩沖鹽和添加劑也是常用手段，有助于改善峰型和保留，緩沖鹽在面對(duì)固定相表面極性層和非極性溶劑時(shí)，更加傾向于溶解于極性層，隨著鹽濃度增加從而增加其親水性， ^[3]。

其中，甲酸銨和乙酸銨是最常用的緩沖鹽，這得益于它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中良好的溶解性以及MS兼容性。需注意的是，隨著鹽濃度的提高，化合物和固定相的離子作用會(huì)受到抑制，主要作用為液液分配 ^[4~7]，這就導(dǎo)致堿性化合物的保留減弱，是因?yàn)榇罅康年庪x子和堿性化合物配對(duì)形成中性離子對(duì)更容易溶于有機(jī)相；相反，酸性化合物保留則會(huì)增加，是由于帶負(fù)電的硅醇離子排斥作用減弱，從而與固定相作用增強(qiáng)。

一些固定相填料表面上具有帶電硅醇，具有一定酸性，在pH5~9時(shí)，硅醇基團(tuán)就處于電離狀態(tài)，對(duì)于帶電狀態(tài)的化合物離子交換作用將扮演重要角色 ^[3]。需注意的是，由于HILIC模式下具有高比例有機(jī)相，高或低pH的緩沖鹽溶于其中時(shí)，其真實(shí)pH值會(huì)由緩沖鹽pH值向中性靠近1~1. ^[8]，使化合物處于電離狀態(tài)的pH值，更利于化合物的保留。

一般酸性化合物在高pH（常用氨水、碳酸氫銨等）條件下保留強(qiáng)于低pH條件，堿性化合物在低pH（常用乙酸、甲酸、乙酸銨、甲酸銨等）條件下保留較好。

HILIC模式溶劑選擇

HILIC模式洗脫溶劑強(qiáng)度為：四氫呋喃 < 丙酮 < 乙腈 < 異丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水（由弱至強(qiáng)），如圖3所示，四氫呋喃、丙酮和乙腈洗脫能力最弱，可作為主要溶劑使用，由于丙酮的截止波長(zhǎng)330nm過高，在UV檢測(cè)器使用受限（可用于CAD、ELSD、MS等），而乙腈是非質(zhì)子溶劑，能夠增加化合物和固定相表面極性層的氫鍵作用，從而增加保留，因此作為最常用流動(dòng)相之一，相當(dāng)于反相中的水相，水的洗脫能力最強(qiáng)，常作為洗脫溶劑使用，可根據(jù)化合物保留情況選擇合適的洗脫溶劑。

圖3：HILIC模式洗脫溶劑強(qiáng)弱順序

HILIC模式注意事項(xiàng)

01 稀釋劑

一般建議選擇流動(dòng)相起始比例溶解樣品。由于HILIC模式乙腈的比例較高，很多大極性化合物難以溶解，為了保證化合物溶解，通常會(huì)將大極性溶劑——如水、甲醇等應(yīng)用于稀釋劑。在這種情況下和常規(guī)反相分離類似，HILIC模式使用強(qiáng)洗脫稀釋劑時(shí)也會(huì)導(dǎo)致溶劑效應(yīng)問題。而二甲基亞砜（DMSO）作為稀釋劑，具有一定保留，并且DMSO在低波長(zhǎng)下有較強(qiáng)的吸收，可能會(huì)影響目標(biāo)化合物出峰，一般配合乙腈、甲醇使用，DMSO比例一般不超過25%。

常規(guī)可以考慮使用75%的乙腈和25%的甲醇混合液作為稀釋劑，也可以加一些添加劑助溶，如甲酸等。需注意的是，樣品的含水量如果過大，也會(huì)影響化合物出峰情況。

02 洗針液

由于大極性化合物的保留極易受大極性洗脫試劑的影響，有時(shí)洗針液中的殘留清洗溶劑會(huì)對(duì)化合物出峰產(chǎn)生影響，或者方法難以重現(xiàn)，一般建議采用流動(dòng)相起始比例洗針。

03 流動(dòng)相

為保證在分析過程中離子強(qiáng)度的穩(wěn)定，可以在水相和有機(jī)相均加入同樣濃度的添加劑，也可以考慮預(yù)混，需注意的是，在流動(dòng)相配制過程中，混合后常常會(huì)產(chǎn)生溫度變化，使用前需放置至室溫。

04 色譜柱再生

色譜柱使用一段時(shí)間后，樣品可能會(huì)殘留在柱頭堵塞柱篩板，這時(shí)可以考慮采用高濃度緩沖鹽低流速進(jìn)行反沖。以默克色譜柱SeQuant? ZIC-HILIC為例，首先采用30倍柱體積的超純水進(jìn)行沖洗，再用30倍柱體積的緩沖鹽（可以用500mM乙酸銨溶液）進(jìn)行沖洗，最后再用30倍柱體積的超純水進(jìn)行沖洗，不同填料處理可能不同。

HILIC模式方法開發(fā)

對(duì)于未知化合物方法開發(fā)，可采用如圖4所示的一般思路進(jìn)行。需注意的是由于HILIC模式化合物保留方式特殊，固定相的極性水層來源于流動(dòng)相，梯度不能變化過快，柱平衡需要留一定時(shí)間。

圖4：HILIC模式未知化合物方法開發(fā)一般思路

對(duì)于已知化合物，則可以根據(jù)化合物性質(zhì)進(jìn)行選擇，首先判斷酸堿性，可以用ACD進(jìn)行模擬，從而進(jìn)行色譜柱的選擇。

表1 色譜柱填料及應(yīng)用范圍

美迪西經(jīng)典案例

01 胺類化合物

氨丁三醇在常規(guī)反相體系下沒有保留，并且沒有紫外吸收，遂采用HILIC模式，選擇CAD檢測(cè)器進(jìn)行方法開發(fā)。氨丁三醇峰型良好，對(duì)稱因子1.2（如圖5所示），線性相關(guān)系數(shù)r 可做到1.000，回收率在97%~104%之間。

圖5：氨丁三醇典型圖譜

02 氨基酸檢測(cè)

氨基酸大多是小分子兩性化合物，在常規(guī)反相分離模式下保留很弱，通常采用衍生法進(jìn)行檢測(cè)，比如說賴氨酸，其 pKa 和 logD 見下圖：

圖6：賴氨酸 pKa

圖7：賴氨酸 logD

賴氨酸的 logD 在所有條件下都是負(fù)值，常規(guī)反相體系無法產(chǎn)生保留行為，我們采用HILIC模式解決了賴氨酸的分析檢測(cè)，得到了良好的保留（8min）和峰型（拖尾因子1.6），大大降低分析成本，便于方法轉(zhuǎn)移和檢測(cè)（如圖8所示）。

圖8：賴氨酸典型圖譜

03 大極性雜質(zhì)

對(duì)于沒有保留、沒有紫外吸收、不能碰水、極性和主成分接近的雜質(zhì)，該如何分析呢？美迪西給出的答案是HILIC-MS模式。如葡甲胺的發(fā)補(bǔ)雜質(zhì)中有一個(gè)席夫堿，該化合物極性大、沒有紫外吸收、見水易分解，該雜質(zhì)和葡甲胺極性接近，常規(guī)方法難以分離。

采用HILIC-MS模式進(jìn)行方法開發(fā)，最終葡甲胺和該席夫堿雜質(zhì)分離度在2.8以上，線性相關(guān)系數(shù)r為1.000，200ppm的LOD信噪比最小為25，回收率在94%~103%之間，且方法耐用性良好，各參數(shù)微小變化下，均可達(dá)到1.5以上基線分離，回收率在98%~102%之間。

圖9：分離度溶液典型圖譜

美迪西分析測(cè)試中心

美迪西已建立完善的分析測(cè)試中心，可以采用豐富的設(shè)備和多種先進(jìn)的技術(shù)（高分辨、LCMSMS、GCMSMS、CAD、NMR、離子色譜、雙三元等等）滿足客戶的各項(xiàng)分析需求！

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（撰稿：李墨；編審：杜建，畢增）

參考資料：

[1] Alpert, A. J., J. Chromatogr. 1990, 499, 177-196.
[2] Waters親水作用色譜, Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain
[3] Jandera, P., J. Sep. Sci. 2008, 31, 1421–1437.

[4] Strege, M. A., Anal. Chem. 1998, 70, 2439-2445.
[5] McCalley, D. V., J. Chromatogr. A 2007, 1171, 46-55.
[6] Naidong, W., J. Chromatogr. B 2003, 796, 209-224.
[7] Liu, M., Ostovic, J., Chen, E. X., Cauchon, N., J. Chromatogr. A 2009, 1216, 2362-2370.
[8] Fountain, K. J., Xu, J., Diehl, D. M., Morrison, D., J. Sep. Sci. 2010, 33, 740-751.

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