高通量篩選服務(wù)

高通量篩選技術(shù)簡介

• 高通量篩選(HTS)是藥物發(fā)現(xiàn)中的一個關(guān)鍵技術(shù)，用于從化合物庫中識別可能成為藥物化學(xué)優(yōu)化的候選化合物。該技術(shù)體系應(yīng)用了藥理學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)、管理技術(shù)以及自動化控制技術(shù)等，實(shí)現(xiàn)了藥物篩選的快速、高效、微量化、自動化和規(guī)?；?/p>

  隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，可以更加快速高效地篩選大量化合物，從而加快藥物發(fā)現(xiàn)的速度。美迪西生物學(xué)和藥理學(xué)部提供高通量篩選服務(wù)，我們擁有強(qiáng)大的級聯(lián)篩選小分子抑制劑、體外的酶活性和細(xì)胞活性檢測開發(fā)能力。

  美迪西的高通量篩選服務(wù)可以做：級聯(lián)篩選小分子抑制劑；體外酶活性測定；體外細(xì)胞活性測定；高通量篩選分析等。

  藥物發(fā)現(xiàn)中的高通量篩選過程涉及篩選大型化合物庫，以找到影響生物靶點(diǎn)的潛在候選化合物。這些候選化合物通常被稱為“苗頭化合物”^[1]。美迪西生物部擁有超過 3000 種化合物的庫，化合物篩選能力可以是 200x384 孔板/周，也可以根據(jù)客戶的需求進(jìn)行定制。同時我們與 Selleck、MCE、Tocris和TargetMol 等提供化合物庫的合作伙伴密切合作。

  高通量篩選過程可以通過各種方法來實(shí)現(xiàn)，包括讀板器以及相應(yīng)的軟件來處理和分析所獲得的數(shù)據(jù)。一旦發(fā)現(xiàn)這些潛在的“苗頭化合物”，對高通量篩選數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析還可以提供有關(guān)第一輪篩選期間獲得的這些“hits”的潛在優(yōu)化的信息^[1]。

級聯(lián)篩選—小分子化合物抑制劑

• 級聯(lián)篩選是藥物發(fā)現(xiàn)過程中識別和選擇先導(dǎo)化合物系列的一套測定方法，作為一種多層次的生物化學(xué)或藥物研究方法，通常用于篩選藥物或化合物庫以尋找潛在的藥物先導(dǎo)化合物。這種方法涉及多個生物學(xué)活性的級別，以便篩選潛在的藥物目標(biāo)。在這個過程中，可能會發(fā)現(xiàn)一些具有潛力的"先導(dǎo)化合物"，這些化合物可以進(jìn)一步開發(fā)成為新藥物。

  

  開發(fā)小分子抑制劑需要強(qiáng)大的級聯(lián)篩選，來有效地識別與靶蛋白結(jié)合的化合物，確定對不需要的相關(guān)蛋白的選擇性，并在下游功能測定中證明活性。

  靶標(biāo)驗證、分析開發(fā)、二次篩選、ADME/Tox 和先導(dǎo)化合物優(yōu)化等領(lǐng)域越來越多地使用 HTS 技術(shù)。

體外酶活性檢測

• 酶活性的變化可以快速調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能或病理過程，激酶、蛋白酶和肽酶是最常見的藥物靶點(diǎn)。利用酶活性分析技術(shù)可以快速、高效地評估化合物對目標(biāo)酶的抑制能力，從而篩選出具有潛力的候選化合物。

  

  酶活性檢測的方法包括酶反應(yīng)的底物、產(chǎn)物等，反應(yīng)大多在均相的環(huán)境下進(jìn)行。底物還原測量（ATP、NAD/NADP、SAM、乙酰輔酶A、肽、DNA、RNA 等）- Down 測定產(chǎn)品測量 - Up 測定

• 酶活性檢測- 案例 1

  HTRF 測定-均相時間分辨熒光

  
  Donor=Eu and Tb
  Acceptor=XL665
  優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)，信號本底比（signal/background ratio）高；（2）熒光信號高度穩(wěn)定；（3）反應(yīng)均相，通量高。缺點(diǎn)：（1）特異性抗體成本較高； （2）針對特定靶點(diǎn)需要開發(fā)特異性抗體。

• 酶活性檢測- 案例 2

  ADP-Glo 檢測

  
  優(yōu)點(diǎn)：(1) 靈敏度高；(2) 可以檢測激酶以外的酶。

• 酶活性檢測- 案例 3

  Z’-Lyte 檢測

  
  優(yōu)點(diǎn)：(1)高信號本底比，高通量；(2)成本低。缺點(diǎn)：(1)無法檢測反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜的酶；(2)難以評價本身有很強(qiáng)的自發(fā)熒光的化合物；(3)檢測蛋白酶時會出現(xiàn)假陽性數(shù)據(jù)。

• 酶分析方法開發(fā)- 關(guān)鍵因素

  酶分析方法優(yōu)化和驗證常采用酶滴定法、時間進(jìn)程分析、米式常數(shù)測定、DMSO耐受性、Z-prime 測試和化合物驗證等。
  

  酶滴定和時間進(jìn)程分析注：窗口（信號本底比）>3。

  

  ATP Km 和底物 Km注：選擇接近Km值的底物濃度
  

  DMSO耐受性：測試測定中可以耐受的最大DMSO濃度。注：DMSO 通常小于 1%

  

  Z’：代表板的均勻性。σ=SD，μ=mean注：Z’>0.5 將作為酶法檢測的 QC 標(biāo)準(zhǔn)
  

  化合物驗證：使用參考化合物來檢測測試的重現(xiàn)性注：IC50應(yīng)為已發(fā)布值的5倍

  Plate layout：

  

  IC50 報告標(biāo)準(zhǔn)最大抑制百分比應(yīng)大于 50%。最高值和最低值應(yīng)在理論值的 15% 以內(nèi)IC50 的 95% 置信限應(yīng)在 2-5 倍范圍內(nèi)。

體外細(xì)胞活性檢測

• 細(xì)胞活性篩選是新藥篩選中的常用方法，在細(xì)胞層面上評估化合物的活性和毒性，能夠很好地模擬藥物在體內(nèi)的作用情況?；诩?xì)胞的檢測已在制藥行業(yè)的藥物篩選中占據(jù)了一定的地位。這些測定能夠通過功能表征潛在藥物靶標(biāo)在細(xì)胞中的作用以及評估藥物先導(dǎo)化合物的特異性和功效來評估潛在藥物靶標(biāo)^[2]。美迪西的體外細(xì)胞檢測服務(wù)包括：
  表型測定：細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、壞死性凋亡、自噬等。 功能測定：下游信號如蛋白磷酸化、第二信使（Ca²⁺、cAMP、IP3、cGMP）。細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）：NanoBiT,NanoBRET,BiFC。
  

  表型測定

  

  第二信使-Ca²⁺

  

  蛋白與蛋白相互作用

• 細(xì)胞檢測開發(fā) - 細(xì)胞毒性測試

  僅使用高通量篩選不能完全評估潛在藥物，因為此評估還需要進(jìn)一步進(jìn)行毒性研究。相反，高通量篩選對于消除在研究對生物靶標(biāo)影響很小或沒有預(yù)期影響的化合物上浪費(fèi)的時間至關(guān)重要。通過利用這種自動篩選過程，可以一起篩選數(shù)百萬種化合物，并消除沒有效果或效果差的化合物^[1]。
  細(xì)胞毒性測試需要從細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時間、DMSO耐受性、Z-prime test、edge effect、化合物驗證幾個方面來考慮。

  1. 細(xì)胞接種密度

  細(xì)胞活力>80%不同細(xì)胞密度的板中的種子細(xì)胞培養(yǎng)72~96小時，CTG/CCK8檢測細(xì)胞活力在線性范圍內(nèi)選擇 CTG/CCK8 信號的密度窗口（信號本底比）>2

  2. 培養(yǎng)時間

  選擇優(yōu)化的密度和種子細(xì)胞在不同時間點(diǎn)孵育細(xì)胞/化合物使用 CTG/CCK8 檢測細(xì)胞活力具有最佳檢測窗口和數(shù)據(jù)質(zhì)量的時間點(diǎn)將用于進(jìn)一步的實(shí)驗窗口（信號本底比）>2
  

  3. DMSO耐受性

  不同劑量的DMSO與細(xì)胞孵育72至96小時，CTG法檢測細(xì)胞活力注意：細(xì)胞檢測中 DMSO 的含量通常低于 0.5%

  4&5. Z-prime test and edge effect

  QC標(biāo)準(zhǔn)：Z’>0.4，窗口>2通常邊緣孔不會用于長期培養(yǎng)

  
  

  6. 化合物驗證

  陽性化合物應(yīng)為參考數(shù)據(jù)的 5 倍

  Plate layout：

  

  

高通量篩選分析

• 高通量篩選分析流程圖

  高通量篩選依靠自動化來快速測試大量化合物，高通量篩選中生成的大量數(shù)據(jù)需要強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理和分析工具。專門的軟件和算法可以用于處理、分析和可視化結(jié)果，使研究人員能夠識別潛在的“苗頭化合物”或表現(xiàn)出所需活性的化合物。
  1. 測定優(yōu)化（Z’、測定窗口、DMSO 耐受性、參考化合物測試）2. 將首先對數(shù)千種化合物進(jìn)行試點(diǎn)研究以測試該測定法3.還將建立正交測定法以消除假陽性化合物4. 對數(shù)以萬計的化合物運(yùn)行 HTS5. 命中率通常會設(shè)置為0.1%到0.5%
  高通量篩選加速了藥物發(fā)現(xiàn)過程，使其更具成本效益和效率，使研究人員能夠快速篩選多種化合物，從而減少識別潛在候選藥物所需的時間。HTS 通常是一個迭代過程，包含多輪篩選、命中驗證和先導(dǎo)化合物優(yōu)化。研究人員根據(jù)早期篩選的結(jié)果和經(jīng)驗來完善他們的化合物庫和測定方法。

• 高通量篩選-案例

  PSMA:

  前列腺特異性膜抗原（PSMA）是治療晚期前列腺癌（PC）和各種實(shí)體瘤的有希望的靶標(biāo)。盡管 PSMA 靶向放射性藥物治療 (RPT) 已實(shí)現(xiàn)顯著的成像和前列腺特異性抗原 (PSA) 反應(yīng)，但積累的臨床數(shù)據(jù)開始揭示某些局限性，包括無反應(yīng)者亞組、復(fù)發(fā)、放射誘導(dǎo)毒性和 需要專門的管理設(shè)施。迄今為止，利用 PSMA 通過抗體、納米藥物或細(xì)胞療法治療 PC 的非放射性嘗試已取得一定成功。 我們開發(fā)了高通量 PSMA 酶測定法來鑒定新的 PSMA 調(diào)節(jié)劑。
  

  底物滴定

  

  參考化合物測試

  Z 因子測試和分析窗口測試

  

  
  使用384孔板進(jìn)行測定驗證，四塊板的數(shù)據(jù)顯示Z因子高于0.5，測定窗口高于10倍。

  苗頭化合物識別

  

  
  總共使用100 x 384孔板篩選了30,000多種化合物，并在10天內(nèi)完成，當(dāng)將PSMA活性抑制設(shè)定為50%時，命中率約為0.8%。

總結(jié)

• 美迪西擁有強(qiáng)大的化合物檢測開發(fā)和化合物篩選能力。我們的篩選能力可以是 200x 384 孔/周，或根據(jù)客戶的需求進(jìn)行定制。樣品是高通量藥物篩選的物質(zhì)基礎(chǔ)，樣品庫來源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。我們與 Selleck、MCE 和 Tocris 等提供化合物庫的合作伙伴密切合作，內(nèi)部擁有超過 3000 種化合物的庫。

附錄

• 來自 MCE（第三方供應(yīng)商）的化合物庫

  化合物庫名稱	規(guī)格和貨號	描述
  50K 多樣性庫	50K  HY-L901	該庫中的化合物通過相異性搜索（谷本相似性系數(shù)為 0.52）進(jìn)行選擇，以提供更高的多樣性和更廣泛的化學(xué)空間覆蓋范圍。
  UORSY篩選庫	680K  HY-L0103V	UORSY 篩選化合物庫包含約 680,000 種化合物。 該文庫是通過聚合合成方法構(gòu)建的，提供了高度多樣化的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 庫中超過85%的化合物具有類藥的理化性質(zhì)，超過35%的化合物具有“l(fā)ead-like”的性質(zhì)。
  生物活性化合物庫 Plus	20K  HY-L001P	? 生物活性和安全性經(jīng)臨床前研究和臨床試驗證實(shí)。有些已獲得 FDA 批準(zhǔn)。 ? 廣泛應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、神經(jīng)信號、免疫等研究重點(diǎn)領(lǐng)域。
  多肽庫	1.1K  HY-L105	? 包括生物活性肽、氨基酸衍生物和封閉肽。 ? 多肽藥物發(fā)現(xiàn)和疫苗開發(fā)的有用工具。
  1,000萬虛擬類藥多樣庫	10M  HY-L912V	MCE 的 40,662 個 BB，涵蓋約 273 種反應(yīng)類型，生成了超過 4000 萬個分子。選擇符合 Ro5 標(biāo)準(zhǔn)的化合物。移除掉不適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，例如 PAINS 基序和合成上難以獲得的結(jié)構(gòu)。 基于摩根指紋圖譜進(jìn)行分子聚類分析，提取靠近每個聚類中心的分子，形成類藥物且可合成的多樣性庫。 這些選定的分子擁有 805,822 個獨(dú)特的 Bemis-Murcko 支架 (BMS)，具有多樣化的化學(xué)空間。 強(qiáng)烈推薦該庫用于基于人工智能的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)、超大規(guī)模虛擬篩選和新的先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)。
  膜受體靶向化合物庫	4.2K  HY-L150	? 4333種膜受體靶向化合物獨(dú)特集合。 ? FGFR、TRP 通道、VEGFR、TNF 受體、阿片受體、5-HT 受體、離子通道等靶點(diǎn)。
  片段化合物庫	22K  HY-L032	? 獨(dú)特的21965 個片段化合物集合，用于通過高通量篩選(HTS) 進(jìn)行傳統(tǒng)先導(dǎo)化合物鑒定。 ? 基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法(FBDD) 的有用工具。
  中藥單體化合物庫	2.7K   HY-L065	? 獨(dú)特的2712 種中藥活性化合物集合，用于高通量篩選(HTS) 和高內(nèi)涵篩選(HCS)。 ? 庫中的化合物包含糖類和糖苷、苯丙素、醌類、黃酮類、萜類和糖苷、類固醇、生物堿、酚類、酸類和醛類。

  這些庫可在 MCE（MedChemExpress，第三方供應(yīng)商）中找到， 我們可以與 MCE 合作使用它們。 我們擁有的一個是中藥單體化合物庫。

• 來自 Targetmol（第三方供應(yīng)商）的化合物庫

  名稱	規(guī)格及貨號	簡介
  2600萬虛擬篩選庫	26M	由Targetmol整理的開源數(shù)據(jù)庫，收錄了全球主要的篩選化合物產(chǎn)品數(shù)據(jù)，包含千萬級的化合物結(jié)構(gòu)，致力于為全球科研人員提供一個穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)庫。
  100K多樣性預(yù)制化合物庫	100K & DS7000	基于160萬篩選化合物和130億類藥和類先導(dǎo)化合物的虛擬空間精心挑選而出，旨在提供新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
  多樣性核心預(yù)制庫	50K & LF1000	精心挑選50000種具有優(yōu)良理化特性的類藥分子，以較小的化合物數(shù)量實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)多樣性的篩選目的。這些化合物基于新合成的化合物集合，使用結(jié)構(gòu)差異性方法篩選而出。
  EXP多樣性庫	50K & CB1100	基于50萬類先導(dǎo)和類藥化合物集合精心挑選而出，旨在提供多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)出良好的類藥和類先導(dǎo)特性，適用于多種研究目的使用
  藥物靶點(diǎn)庫	53K & DO1200	基于“靶點(diǎn)多樣性”概念和現(xiàn)有數(shù)據(jù)，通過計算機(jī)虛擬篩選、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、體外、細(xì)胞和表型預(yù)測等多種工具，對Chemdiv 160萬個化合物進(jìn)行篩選，得到5.3萬個類藥分子，涵蓋200多個藥物靶點(diǎn)。
  多樣性核心庫Part1	50K & DF4500	精選5萬種化合物，覆蓋160萬種化合物的結(jié)構(gòu)空間。該庫在剔除PAINS、經(jīng)過REOS和MedChem過濾器后，專注優(yōu)化化合物結(jié)構(gòu)的多樣性。
  代表性核心庫（基于Bemis-Murcko Clustering算法）	300K & DD3700	基于Bemis-Murcko-clustering理論生成BMS骨架，經(jīng)聚類分析、類藥性質(zhì)分析，獲得的多樣性庫。
  DGK抑制劑庫	12K & L9920	收集880余種DGK抑制劑分子作為模板分子，然后分別使用3D藥效團(tuán)建模和子結(jié)構(gòu)搜索篩選/生物等排替代方式對160萬小分子進(jìn)行篩選構(gòu)建而成。
  共價抑制劑庫	12K & DO2200	Chemdiv共價抑制劑庫旨在覆蓋用作共價反應(yīng)基團(tuán)的常見彈頭，另外從庫存的砌塊化合物中選取多樣的特有和獨(dú)特結(jié)構(gòu)作為導(dǎo)引頭，設(shè)計合成各類共價抑制劑。共價抑制劑通用庫包含了各類常見的共價反應(yīng)基團(tuán)化合物。
  CNS MPO庫	30K & DP2250	使用gMPO對Chemdiv 160萬庫存化合物進(jìn)行篩選評估，選取評分不低于4的化合物；然后利用藥化過濾器進(jìn)行篩選，結(jié)構(gòu)富集，最終得到此庫。
  3D生物活性多樣性庫	22K & D8800	該庫收集的小分子具有較好的核心骨架結(jié)構(gòu)、三維空間結(jié)構(gòu)和藥效團(tuán)，展示出廣泛的生物學(xué)活性，它們潛在的靶標(biāo)包括酶、膜受體、轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳調(diào)節(jié)劑、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他蛋白質(zhì)，同時具有良好的ADMET性能。該庫包括蛋白質(zhì)抑制劑/激活劑和受體激動劑/拮抗劑，活性化合物具有較低的分子量，較佳的LogP值和較佳的溶解度。
  已知活性化合物庫	22K & L4010	已知活性庫是 22555 個具有生物活性，能引起細(xì)胞、組織甚至個體生物學(xué)反應(yīng)的化合物的集合。包括了正在進(jìn)行臨床前研究的藥物分子，臨床期的藥物分子和已經(jīng)上市的藥物。靶點(diǎn)明確，信息全面，非常適合完成藥物功能重定位、小分子誘導(dǎo)細(xì)胞分化以及機(jī)制研究中蛋白靶點(diǎn)確認(rèn)等科研工作。
  天然產(chǎn)物庫	4533 & L6000	TargetMol天然產(chǎn)物庫精選了4533 種天然產(chǎn)物單體，這些天然產(chǎn)物單體來源豐富，結(jié)構(gòu)多樣，具有很強(qiáng)的代表性。它們存在于三千余種中草藥植物、動物以及微生物中提取純化的天然來源中，涵蓋了五百余種不同骨架結(jié)構(gòu)和千余種靶點(diǎn)受體，大部分成分都達(dá)到對照品純度。不僅如此，庫中還包含了眾多單價極高的稀有天然產(chǎn)物，性價比高。

  這些庫可在Targetmol（TargetMol Chemicals，第三方供應(yīng)商）中找到， 我們可以與TargetMol合作使用它們。
• 參考文獻(xiàn)：
  [1] Coma, I. et al. Process validation and screen reproducibility in high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 14, 66–76 (2009).doi: 10.1177/1087057108326664
  [2] Pawe? Szymański, Magdalena Markowicz,* and El?bieta Mikiciuk-Olasik. Adaptation of High-Throughput Screening in Drug Discovery—Toxicological Screening Tests. Int J Mol Sci. 2012; 13(1): 427–452.Published online 2011 Dec 29. doi: 10.3390/ijms13010427

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